Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

स्त्री रोग और यूरोलॉजिकल कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलांटोइक झिल्ली का उपयोग करना

Published: January 28, 2020 doi: 10.3791/60651
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles

Summary

हम स्त्री रोग और मूत्र कैंसर कोशिका लाइनों और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर के एनग्राफमेंट के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलैंटोइक झिल्ली मॉडल को एक विकल्प, प्रत्यारोपण योग्य के रूप में प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

माउस मॉडल वीवो कैंसर अध्ययन में बेंचमार्क परीक्षण हैं। हालांकि, लागत, समय, और नैतिक विचार ों के कारण वीवो कैंसर मॉडल में वैकल्पिक के लिए कॉल किया गया है। चिकन कोरियोएलन्टोइक झिल्ली (सीएएम) मॉडल एक सस्ता, तेजी से विकल्प प्रदान करता है जो ट्यूमर विकास के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है और वीवो इमेजिंग में उपयुक्त है। जैसे, हमने इस मॉडल में स्त्री रोग और मूत्र संबंधी ट्यूमर को एनग्राफ्टिंग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करने की मांग की, जिसे हम यहां प्रस्तुत करते हैं। लगभग 7 दिन पोस्टफर्टिलाइजेशन, एयर सेल को अंडे के संवहनी पक्ष में ले जाया जाता है, जहां खोल में एक उद्घाटन बनाया जाता है। murine और मानव कोशिका लाइनों और प्राथमिक ऊतकों से ट्यूमर तो engrafted किया जा सकता है । ये आम तौर पर सेलुलर फैलाव से बचने के लिए बाह्य मैट्रिक्स और मध्यम के मिश्रण में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और पोषक तत्वों का समर्थन प्रदान करते हैं जब तक कि कोशिकाएं संवहनी आपूर्ति की भर्ती नहीं करतीहैं। ट्यूमर तो अंडे हैचिंग से पहले एक अतिरिक्त 14 दिनों के लिए विकसित हो सकता है । जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के साथ कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके, पूरे भ्रूण में फैले झिल्ली और कैंसर कोशिका पर ट्यूमर के विकास के संवेदनशील पता लगाने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग संभावित रूप से ट्यूमर, आक्रमण, मेटाटैसिस और चिकित्सीय प्रभावशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। चिकन कैम मॉडल पारंपरिक मूत्र मॉडल की तुलना में काफी कम समय और वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता है। क्योंकि अंडे इम्यूनोसमझौता और प्रतिरक्षा सहिष्णु हैं, किसी भी जीव से ऊतकों को संभावित रूप से मानव ऊतकों के प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक महंगे ट्रांसजेनिक जानवरों (जैसे, चूहों) के बिना प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हालांकि, इस मॉडल के लाभों के कई संभवतः भी सीमाएं हो सकती है, कम ट्यूमर पीढ़ी के समय और इम्यूनोसमझौता/ इसके अतिरिक्त, हालांकि सभी ट्यूमर प्रकार चिकन chorioallantoic झिल्ली मॉडल में यहां प्रस्तुत किया, वे ट्यूमर के विकास की डिग्री बदलती के साथ ऐसा करते हैं ।

Introduction

चूहों ने मानव रोगों के अध्ययन के लिए क्लासिक मॉडल जीव के रूप में कार्य किया है, जिसमें द्रोह भी शामिल है । स्तनधारियों के रूप में, वे मनुष्यों के साथ कई समानताएं साझा करते हैं। उनकी उच्च स्तर की आनुवंशिक समानता ने माउस जीनोम के ट्रांसजेनिक हेरफेर की अनुमति दी है ताकि मानव रोगों के आनुवंशिक नियंत्रण के बारे में अत्यधिक जानकारी प्रदान की जा सके। चूहों के साथ हैंडलिंग और प्रयोग में व्यापक अनुभव के परिणामस्वरूप उनके जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए पसंद का मॉडल है। हालांकि, मूत्र मॉडल के बारे में नैतिक और वैज्ञानिक चिंताओं के अलावा, वे काफी महंगे और समय लेने वाले2,3 भी हो सकतेहैं। ट्यूमर के विकास में सप्ताह या महीनों भी लग सकते हैं। अकेले एक ठेठ संस्था में आवास डॉलर के हजारों के लिए सैकड़ों में चला सकते हैं, जबकि ट्यूमर विकसित कर रहे हैं । ओवेरियन कैंसर इस खामी का एक उदाहरण है क्योंकि मूत्र मॉडल में इसकी वृद्धि में आसानी से महीनों लग सकते हैं। अनुसंधान प्रगति में देरी संभावित प्रभाव अंडाशय कैंसर रोगियों ' लगातार कम 5 साल के जीवित रहने की दर केवल ४७% (यानी, 30 साल से अधिक केवल 10% के अस्तित्व में वृद्धि)4। इसी तरह, यूरोलॉजिकल कैंसर (गुर्दे, प्रोस्टेट, और मूत्राशय के कैंसर) संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी कैंसर के मामलों का 19% और कैंसर से संबंधित मौतों का 11% का गठन4। इस प्रकार, स्त्री रोग और मूत्र संबंधी कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो दृष्टिकोण में एक उपन्यास एक प्रयोगशाला काफी समय, श्रम और धन को बचा सकता है, भले ही यह मॉडल केवल प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रयोगों पर लागू हो। इसके अतिरिक्त, अनुसंधान निष्कर्षों के परिणामस्वरूप त्वरण काफी १७७,००० इन कैंसर के साथ सालाना का निदान व्यक्तियों को प्रभावित कर सकता है ।

चिकन कैम मॉडल कई फायदे प्रदान करता है जो उपरोक्त मुद्दों को संबोधित करते हैं। एंजियोजेनेसिस5,6,ट्यूमर सेल आक्रमण7,8,और मेटास्तासिस7,9का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल, चिक भ्रूण कैम मॉडल का उपयोग पहले से ही कैंसर के कई रूपों का अध्ययन करने के लिए किया जा चुका है, जिसमें ग्लियोमा10,11,12,सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा13,14,ल्यूकीमिया15,16,अग्नाशय का कैंसर17,और कोलोरेक्टल कैंसर18. इसके अतिरिक्त, न्यूरोब्लास्टोमा19,बर्किट लिंफोमा20,मेलानोमा21और फेलिन फाइब्रोसारकोमा22के लिए कैम मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। पूर्व अध्ययनों में मूत्राशय के कैंसर23 और प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों24का एनग्राफमेंट भी प्रस्तुत किया गया है, लेकिन सीमित प्रोटोकॉल विवरण के साथ। न केवल चूहों की तुलना में अंडे बहुत सस्ते होते हैं, बल्कि वे25,26के अत्यधिक प्रजनन योग्य परिणाम भी पैदा करते हैं। वे तेजी से वास्कुलचर विकास दिखाते हैं, और ट्यूमर एनग्राफमेंट कुछ दिनों के रूप में जल्दी हो सकता है और खुली खिड़की के माध्यम से देशवासी कल्पना की जा सकती है। अंडे निषेचन और हैचिंग के बीच 21 दिन की समय सीमा के साथ, प्रयोगों को कुछ हफ्तों के भीतर पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, कम लागत, सीमित आवास की जरूरत है, और छोटे आकार आसानी से बड़े पैमाने पर प्रयोगों की अनुमति है कि माउस अध्ययन के लिए निषेधात्मक होगा ।

इसलिए, हमने स्त्री रोग और मूत्र कैंसर के एनग्राफमेंट के लिए कैम मॉडल को अनुकूलित करने की मांग की। जल्दी चिकन भ्रूण27की इम्यूनोसमझौता स्थिति के कारण, माउस और मानव कोशिकाओं दोनों को आसानी से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। जैसे, हमने ओवेरियन, किडनी, प्रोस्टेट और मूत्राशय के कैंसर को सफलतापूर्वक एनग्राफेड किया है। इन ट्यूमर प्रकार ों में से प्रत्येक के लिए, कैम आसानी से स्थापित मूत्र और/या मानव ट्यूमर सेल लाइनों को स्वीकार करता है । महत्वपूर्ण बात, हौसले से काटा प्राथमिक मानव ट्यूमर ऊतकों भी या तो पचा कोशिकाओं या सफलता की उच्च दरों के साथ ठोस ऊतक के टुकड़े से engraft कर सकते हैं । इन कैंसर प्रकारों और कोशिका स्रोतों में से प्रत्येक अनुकूलन की आवश्यकता है, जो हम यहां साझा करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां प्रस्तुत किए गए सभी प्रयोगों की समीक्षा की गई और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स (यूसीएलए) में उपयुक्त नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया । डीईचिन्हित, प्राथमिक मानव ट्यूमर के उपयोग को यूसीएलए इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (प्रोटोकॉल संख्या 17-000037, 17-001169 और 11-001363) द्वारा अनुमोदित किया गया है। UCLA में, पशु अनुसंधान समिति की समीक्षा चिकन भ्रूण का उपयोग कर प्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं है; प्रोटोकॉल अनुमोदन केवल तभी आवश्यक है जब अंडे रची जाएंगी। हालांकि, जानवरों की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशानिर्देश के रूप में सबसे अच्छी प्रथाओं, चिकन भ्रूण नैतिकता की दृष्टि से संभालने के लिए और जितना संभव हो दर्द से बचने के लिए इस्तेमाल किया गया । शोधकर्ताओं से आग्रह किया जाता है कि वे कैम मॉडल का उपयोग करके अध्ययन शुरू करने से पहले अपनी संस्था में निरीक्षण आवश्यकताओं को सत्यापित करें ।

1. अंडे तैयार करना

  1. अंडे प्राप्त करने से पहले, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 60-70% आर्द्रता के साथ अंडे के इनक्यूबेटर को 37.8 डिग्री सेल्सियस (100 डिग्री एफ) तक इकट्ठा और समतुल्य करें।
    नोट: संदूषण जोखिमों को कम करने के लिए, आर्द्रता को नियंत्रित करने के लिए स्वचालित पानी का उपयोग किया जा सकता है।
  2. निषेचित प्राप्त करने पर, रोड आइलैंड लाल चिकन अंडे एक प्रमाणित प्रयोगशाला ग्रेड अंडे आपूर्तिकर्ता से, सूखी कागज तौलिए के साथ गोले की सतह पोंछ । पालन सामग्री को हटाने के लिए हल्के से घटा कागज तौलिया का उपयोग किया जा सकता है। तुरंत सूखी।
    नोट: 43.3 डिग्री सेल्सियस से नीचे तरल के साथ खोल गीला अंडे में बैक्टीरिया शुरू कर सकते हैं। यदि कोई अंडे को धोने या कीटाणुरहित करने का विकल्प चुनता है, तो तरल का तापमान 43.3-48.9 डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए। उच्च तापमान अंडे उबाल सकते हैं। कीटाणुनाशक का चुनाव चिंता पैदा करने वाले सूक्ष्मजीवों के आधार पर किया जाना चाहिए।
  3. अंडे पर तारीख लेबल करने के लिए एक पेंसिल या मार्कर का प्रयोग करें। यह विकास दिवस 0 माना जाता है।
  4. अंडे को अंडे के इनक्यूबेटर में रखें और कैम विकास की अनुमति देने के लिए रोटेशन के साथ कम से कम 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। एक स्वचालित रोटेटर का उपयोग किया जा सकता है, या अंडे को प्रति दिन 180 डिग्री 2-3x घुमाया जा सकता है।

2. अंडे खोलना

नोट: जब कैम पूरी तरह से विकसित हो जाता है तो अंडों का उद्घाटन किया जाना चाहिए। यह आम तौर पर विकास के दिन 7 या 8 पर है ।

  1. 70% इथेनॉल के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट कीटाणुरहित। इसी तरह कीटाणुरहित और जैव सुरक्षा कैबिनेट में जगह एक अंडा रैक, अंडा मोमबत्ती, मार्कर, एक सिलिकॉन कार्बाइड पीसने पत्थर और परिपत्र काटने पहिया, 18 जी सुई, चौथाई इंच वैक्यूम ट्यूबिंग के साथ पाइप नियंत्रक, पैकिंग टेप, कार्यालय के साथ कॉर्डलेस रोटरी उपकरण कैंची, घुमावदार कैंची, सेमकेन (या इसी तरह) संदंश, कपास गेंदें, और 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग। जब भी संभव हो, बाँझ, डिस्पोजेबल या ऑटोक्लेव किए गए उपकरणों का उपयोग करें।
  2. अंडा रोटेटर बंद कर दें। अंडे रैक पर जैव सुरक्षा कैबिनेट में लगभग 1-3 अंडे रखें। अंधेरे में रहते हुए, अंडे के किले के खिलाफ अंडे के मोमबत्ती रखें ताकि एयर सेल की पहचान की जा सके। एयर सेल की लोकेशन चिह्नित करते हैं।
    नोट: अंडे मोमबत्ती से रोशनी की तीव्रता अंडे के इंटीरियर की कल्पना के लिए महत्वपूर्ण है। यदि एयर सेल या वास्कुलचर लगातार देखना मुश्किल है, तो अंडे की मोमबत्ती की बैटरी को बदलने की कोशिश करें।
  3. एक बड़े रक्त वाहिका नेटवर्क को खोजने के लिए खोल पर अंडे मोमबत्ती ले जाएँ। जरूरत पड़ने पर अंडा घुमाएं। अंडे के बीच के पास एक आदर्श वैकुलचर शाखाओं में बंटी होगी। प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किए जाने वाले वास्कुलचर पर आकर्षित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें।
  4. हुड में प्रकाश चालू करें। सिलिकॉन कार्बाइड पीसने वाले पत्थर के साथ लगे कॉर्डलेस रोटरी टूल का उपयोग करके, हवा सेल के केंद्र पर सीधे खोल में एक छोटा छेद ड्रिल करें। ड्रिल जब तक खोल के अधिकांश हटा दिया गया है, लेकिन सफेद, आंतरिक झिल्ली बरकरार है।
    नोट: वास्कुलचर को लक्षित करने से पहले वायु कोशिका पर ड्रिलिंग कैम और वास्कुलचर के बजाय हवा सेल पर उस विशेष अंडे की मोटाई का निर्धारण करने की अनुमति देता है। यदि कैम या वास्कुलचर बाधित होता है, तो अंडा प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने योग्य नहीं है।
  5. ड्रिल करें और एक और छोटा छेद खोलें जहां संवहनी खिड़की खोली जाएगी जैसा कि वायु कोशिका (चरण 2.4) के लिए किया गया था।
  6. 18 जी सुई का उपयोग करना, धीरे हवा की कोशिका और वास्कुलचर पर सफेद, आंतरिक झिल्ली के माध्यम से छेदकरें। यदि खोल में प्रवेश करने में असमर्थ है, तो ध्यान से थोड़ा और ड्रिल करें। सुनिश्चित करें कि सफेद, आंतरिक झिल्ली (लेकिन कैम नहीं) ड्रिल क्षेत्र की संपूर्णता में बाधित होती है। झिल्ली के टुकड़े को हटाना आवश्यक नहीं है।
    नोट: यदि इस चरण के दौरान कैम या वास्कुलचर बाधित होता है, तो अंडे को त्याग दें। नुकसान स्पष्ट है अगर वहां रक्त या एल्बुमिन एक ड्रिल छेद से लीक है ।
  7. हुड लाइट बंद कर दें। अंडे मोमबत्ती का उपयोग करके, सत्यापित करें कि वायु कोशिका अंडे के अंत से वस्कुलचर पर क्षेत्र में स्थानांतरित कर दी गई थी। यदि आवश्यक हो, तो मूल वायु कोशिका पर छेद के चारों ओर एक पाइप्ट नियंत्रक में डाला वैक्यूम ट्यूबिंग रखें और वायु कोशिका को स्थानांतरित करने के लिए धीरे-धीरे छोटे फटने में सक्शन लागू करें।
  8. एयर-कैम सीमा के अंदर लगभग 0.5 सेमी एयर सेल के नए स्थान को रेखांकित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें। सिर्फ नई हवा सेल पर टेप पैकिंग का एक टुकड़ा प्रत्यय । यदि आवश्यक हो, तो टेप को उचित आकार में ट्रिम करने के लिए मानक कार्यालय कैंची का उपयोग करें।
    नोट: टेप खोल के माध्यम से एयरफ्लो को बाधित कर सकता है और वायु कोशिका को पूरी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक से बड़ा नहीं होना चाहिए।
  9. नए एयर सेल का सामना करना पड़ के साथ रोटेशन के बिना गर्म करने के लिए इनक्यूबेटर के लिए अंडे वापस । शेष अंडों को खोलने के लिए चरण 2.2-2.9 दोहराएं।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रुका हो सकता है । यदि कैम विकास की गुणवत्ता के बारे में अनिश्चित है, तो शेष अंडों को खोलने से पहले कम संख्या में अंडे चरण 2.16 के माध्यम से आगे बढ़ना चाहिए।
  10. जैव सुरक्षा कैबिनेट में अंडे रैक पर जगह ति हवा कोशिकाओं के साथ लगभग 1-3 अंडे रखें।
    नोट: खुले अंडे में संदूषण शुरू करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसलिए, हमेशा एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर अंडे खोलें, और जब भी संभव हो बाँझ उपकरणों और उपकरणों का उपयोग करें।
  11. एक गोलाकार काटने पहिया के साथ लगे एक कॉर्डलेस रोटरी उपकरण का उपयोग करना, कदम 2.8 में तैयार एयर सेल सीमा पर एक छोटी सी लाइन काट दिया। सुनिश्चित करें कि यह कैम या वास्कुलचर को बाधित करने से बचने के लिए वास्तविक एयर-कैम सीमा के अंदर लगभग 0.5 सेमी है। खोल के माध्यम से पूरी तरह से कटौती लेकिन सीएएम या वास्कुलचर को बाधित करने के लिए गहराई से पर्याप्त प्रवेश न करने के लिए सावधान रहें।
  12. घुमावदार कैंची का उपयोग करना, शेष वायु कोशिका के चारों ओर काटखोल में एक खिड़की बनाने के लिए।
    नोट: यदि निकाले गए खोल पर रक्त या झिल्ली मौजूद है, तो अंडा प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं है। यदि अंडे का एक उच्च अनुपात सफाई से नहीं खोला जाता है, तो बेहतर कैम गठन की अनुमति देने के लिए शेष अंडों को खोलने के लिए कम से कम 1 अतिरिक्त दिन इंतजार करने पर विचार करें। यदि शेष अंडों के गोले नहीं छेदे गए हैं, तो इनक्यूबेटर के भीतर अंडों का रोटेशन फिर से शुरू किया जाना चाहिए।
  13. भ्रूण की व्यवहार्यता सत्यापित करें। व्यवहार्य भ्रूण व्यापक वास्कुलचर, स्पष्ट एल्बुमिन, भ्रूण आंदोलन, या एक दृश्य दिल की धड़कन प्रदर्शित करेगा ।
  14. सेमकेन संदंश का उपयोग करके, एक बाँझ कपास की गेंद से कपास के छोटे टुकड़े खींचें। शेल धूल और मलबे को हटाने के लिए कैम सतह को धीरे-धीरे दागें।
    नोट: मलबे को हटाने के एक ही दिन है कि अंडे खोला जाता है पर किया जाना चाहिए ।
  15. 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के एक चौथाई टुकड़े के साथ खोल खोलने को कवर करें।
  16. अंडे को इनक्यूबेटर पर लौटा दें। सुनिश्चित करें कि अंडा खुली खिड़की का सामना करना पड़ रहा है और कैम पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग को छूने नहीं के साथ सुरक्षित रूप से बैठता है । अंडे के रैक के एक टुकड़े, अंडे रोटेटर के किनारे, या किसी अन्य उपयुक्त आइटम का उपयोग किसी भी अंडे को सहारा देने के लिए करें जो रोलिंग रखते हैं।
  17. सभी शेष अंडों को खोलने के लिए चरण 2.10-2.16 दोहराएं।
    नोट: अंडे के उद्घाटन के लिए प्रत्यारोपण के रूप में एक ही दिन पर पूरा करने की जरूरत नहीं है । कम से कम 1 दिन इंतजार करने से उन अंडों को खत्म करने में मदद मिल सकती है जिनकी व्यवहार्यता खोल खोलकर समझौता किया गया था।

3. प्रत्यारोपण के लिए कैंसर सेल निलंबन की तैयारी (विकल्प 1)

नोट: यह प्रत्यारोपण से ठीक पहले पूरा किया जाना है, जो आदर्श रूप से 7 और 10 दिनों के बीच होना चाहिए । प्रत्यारोपण की तारीख से संबंधित अधिक जानकारी के लिए 5 या 6 कदम की शुरुआत में नोट्स देखें। इस दृष्टिकोण सभी सेल लाइनों और सुसंस्कृत गुर्दे के कैंसर ट्यूमर पचाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

  1. बर्फ पर बाह्य मैट्रिक्स समाधान गल।
  2. यांत्रिक और/या एंजाइमैटिक पाचन का उपयोग करना, कोशिका प्रकार प्रत्यारोपित किए जाने के लिए उपयुक्त विधि का उपयोग करके एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करें।
  3. प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त माध्यम में प्रत्यारोपित की जाने वाली कोशिकाओं की कुल संख्या को फिर से निलंबित करें। प्रति अंडे 1-2 x 106 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण विशिष्ट हैं।
    नोट: सेल लाइनों के प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम आमतौर पर कोशिकाओं को सफ़ेद करने के लिए उपयोग किया जाने वाला पूरा माध्यम होता है, जिसमें एफबीएस या सीरम प्रतिस्थापन होता है। ट्यूमर डाइजेस्ट का प्रत्यारोपण आम तौर पर एक ही कैंसर प्रकार की कोशिका रेखाओं को संभोग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण माध्यम का उपयोग करता है। हालांकि, यदि प्रायोगिक रूप से आवश्यक हो तो मध्यम निर्माण में समायोजन किया जा सकता है। ट्यूमर के विकास और विकास पर प्रभाव अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।
  4. एक अपकेंद्रित्र गति और कोशिकाओं के लिए उपयुक्त समय का उपयोग कर कोशिकाओं को गोली । विशिष्ट गति 250-300 x ग्रामहैं, और समय 5-10 0 0 वर्ष हैं।
  5. पाइपिंग द्वारा पैलेट कोशिकाओं से अधिनायक को हटा दें। यांत्रिक रूप से फ्लिकिंग या पाइपटिंग के माध्यम से अवशिष्ट माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें। उचित आकार के पाइप्ट का उपयोग करके कोशिकाओं और मध्यम की मात्रा को मापें।
  6. प्रत्यारोपण मात्रा की गणना करें जैसे कि 1-2 x 106 कोशिकाओं को 2.7-4 मिलीग्राम/mL प्रोटीन की अंतिम बाह्य मैट्रिक्स एकाग्रता के साथ प्रति अंडे 20-100 माइक्रोन की मात्रा में प्रत्यारोपित किया जाता है। इस गणना के अनुसार मध्यम, किसी भी वांछित विकास कारक या एडिटिव्स और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स समाधान जोड़ें। प्रत्यारोपण के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
    नोट: चरण 3.3 और 3.6 में गणना के लिए, समूह में सभी अंडों के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए कम से कम डेढ़ अंडे प्रत्यारोपण की एक अतिरिक्त मात्रा शामिल की जानी चाहिए। अंडाशय के कैंसर सेल लाइनों (यानी, SKOV3 और ID8) के प्रत्यारोपण के लिए प्रति अंडा 106 कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया गया। गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा सेल लाइन RENCA के प्रत्यारोपण के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं पचा प्राथमिक मानव गुर्दे सेल कार्सिनोमा, प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों (यानी, CWR, C4-2, और MyC-CaP), और मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों (यानी, एचटी-१३७६ और T24), 2 x १०६ कोशिकाओं से प्राप्त प्रत्यारोपित किया गया ।

4. प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर टुकड़े तैयार करना (विकल्प 2)

नोट: यह प्रत्यारोपण से ठीक पहले पूरा किया जाना है, जो आदर्श रूप से 7 और 10 दिनों के बीच होना चाहिए । प्रत्यारोपण की तारीख से संबंधित अधिक जानकारी के लिए 5 या 6 कदम की शुरुआत में नोट्स देखें। प्राथमिक अंडाशय और मूत्राशय के कैंसर ट्यूमर टुकड़े के रूप में प्रत्यारोपित किया गया ।

  1. बर्फ पर एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स समाधान गल। किसी भी वांछित विकास कारकया योजक वाले उपयुक्त माध्यम में 2.7-4 मिलीग्राम/mL की अंतिम प्रोटीन एकाग्रता को पतला करें। बर्फ पर रखें।
    नोट: ट्यूमर के टुकड़ों का प्रत्यारोपण आम तौर पर एक ही कैंसर प्रकार की कोशिका लाइनों को संभोग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण माध्यम का उपयोग करता है। हालांकि, यदि प्रायोगिक रूप से आवश्यकता हो तो मध्यम निर्माण में समायोजन किया जा सकता है। ट्यूमर engraftment और विकास पर प्रभाव अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।
  2. ताजा ट्यूमर से स्केलपेल या कैंची, उत्पाद के टुकड़े का उपयोग करना। आदर्श आकार प्रत्येक तरफ 2-5 मिमी से लेकर होते हैं। प्रत्यारोपण के लिए तैयार होने तक ऊतकों को माध्यम में डुबोकर रखें।

5. नॉनस्टिक रिंग का उपयोग करके प्रत्यारोपण (विकल्प 1)

नोट: कोशिकाओं को विकास दिवस 7 पर शुरू प्रत्यारोपित किया जा सकता है अगर सीएएम पूरी तरह से विकसित है । प्रत्यारोपण हैचिंग से पहले किसी भी समय हो सकता है कि ट्यूमर के विकास और वांछित प्रयोग के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है, लेकिन ध्यान दें कि भ्रूण की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दिन 10 postfertilization27के आसपास मौजूद होना शुरू करते हैं । ट्यूमर की वृद्धि दर सेल प्रकार से काफी भिन्न होती है और कोशिका प्रकार के हित के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। ओवेरियन कैंसर और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को नॉनस्टिक रिंग विधि का उपयोग करके प्रत्यारोपित किया गया था। ध्यान दें कि जब एक नॉनस्टिक रिंग उपलब्ध नहीं है, तो एक पाइप टिप को समान आकार में काटा जा सकता है और उपयोग किया जा सकता है।

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी आवश्यक उपकरणों कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें: एक अंडा रैक, घुमावदार आईरिस संदंश, नॉनस्टिक रिंग्स (1/4 इंच आंतरिक व्यास), ग्लास हलचल रॉड, उचित मात्रा पिपेट और टिप्स, 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग, कार्यालय कैंची, और मार्कर या पेंसिल। जब भी संभव हो, बाँझ, डिस्पोजेबल या ऑटोक्लेव किए गए उपकरणों का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में अंडे रैक पर प्रत्यारोपित करने के लिए अंडे रखें। अंडों की एक प्रबंधनीय संख्या का चयन करें। छह तक विशिष्ट है। उनके साथ काम करते समय अंडों को काफी ठंडा होने देने से बचें।
  3. खोल के टुकड़ों को दूर खींचने से बचने के लिए खुली खिड़की की ओर किनारों रोलिंग द्वारा खोल से पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग निकालें । जांच करें कि अंडे व्यवहार्य और स्वस्थ हैं। आदर्श अंडे में खुले क्षेत्र के केंद्र में एक बड़ा पोत होगा जिसमें छोटे जहाजों से शाखाओं में बंटी होगी।
  4. घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग करके, पोत पर सीएएम पर एक बाँझ, नॉनस्टिक रिंग रखें, आदर्श रूप से एक शाखा बिंदु पर। धीरे कैम abrade करने के लिए एक बाँझ ग्लास हलचल रॉड का प्रयोग करें।
  5. नॉनस्टिक रिंग के केंद्र में चरण 3.6 से सेल निलंबन को पिलेट करें। वैकल्पिक रूप से, चरण 4.2 से ट्यूमर टुकड़ा को नॉनस्टिक रिंग के केंद्र में रखने और चरण 4.1 में उत्पन्न एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स समाधान के 20-50 माइक्रोन के साथ कवर करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  6. 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के एक चौथाई टुकड़े के साथ खोलने पर मुहर। एक उपयुक्त प्रत्यारोपण पदनाम के साथ अंडे लेबल।
    नोट: एक समूह के भीतर अंडे की संख्या देशीय टिप्पणियों की सुविधा ।
  7. अंडा को इनक्यूबेटर पर लौटाएं। सुनिश्चित करें कि खोल का उद्घाटन सीधा बैठता है और अंडा सुरक्षित है।
    नोट: अंडे रोटेशन के बिना एक अंडे इनक्यूबेटर को वापस किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उच्च पोस्टइम्प्लांट व्यवहार्यता सीओ2 निष्क्रिय और आर्द्रता की निगरानी के लिए एक हाइग्रोमीटर के साथ 37-38 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है, जो 50%-80% होना चाहिए।

6. बिना स्टिक रिंग के प्रत्यारोपण (विकल्प 2)

नोट: कोशिकाओं को विकास दिवस 7 पर शुरू प्रत्यारोपित किया जा सकता है अगर सीएएम पूरी तरह से विकसित है । प्रत्यारोपण हैचिंग से पहले किसी भी समय हो सकता है कि ट्यूमर के विकास और वांछित प्रयोग के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है, लेकिन ध्यान दें कि भ्रूण की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दिन 10 postfertilization27के आसपास मौजूद होना शुरू करते हैं । इस विधि का उपयोग गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा कोशिकाओं और मूत्राशय कैंसर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए किया गया था।

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी आवश्यक उपकरणों कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें: उचित मात्रा पिपेट और सुझाव, बाँझ 10-सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन, अंडा रैक, 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग, कार्यालय कैंची, और मार्कर।
  2. एक उचित आकार के पाइपटिप (200 माइक्रोन विशिष्ट है) में चरण 3.6 में उत्पन्न सेल निलंबन की एक टीका मात्रा को एस्पिरेट करें। टिप के शीर्ष भाग को पकड़ते समय, ध्यान से पिपेट टिप को बाहर निकालें और क्षैतिज रूप से एक बाँझ, 10-सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में रखें।
  3. प्रत्येक समूह के लिए एक डिश के साथ एक समूह के भीतर सभी नमूनों के लिए चरण 6.2 दोहराएं।
  4. एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को आंशिक रूप से बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए 15-30 ग्राम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सुझाव रखें।
  5. ऊष्मायन के 15 मिन के बाद, बहुलीकरण के लिए जांच शुरू करते हैं। तरल की एक छोटी राशि आम तौर पर टिप से बाहर लीक जब पकवान पर रखा । इस तरल के बहुलककरण का उपयोग टिप के भीतर तरल के बहुलककरण की सीमा का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।
  6. अंडे को बायोसेफ्टी कैबिनेट में अंडे की रैक पर प्रत्यारोपित करने के लिए रखें। अंडों की एक प्रबंधनीय संख्या का चयन करें। छह तक विशिष्ट है। उनके साथ काम करते समय अंडों को काफी ठंडा होने देने से बचें।
  7. खुली खिड़की की ओर किनारों रोलिंग द्वारा खोल से पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग निकालें। यह खोल के टुकड़ों को दूर खींचने से बचा जाता है।
  8. जांच करें कि अंडे व्यवहार्य और स्वस्थ हैं। आदर्श अंडे में खुले क्षेत्र के केंद्र में एक बड़ा पोत होगा जिसमें छोटे जहाजों से शाखाओं में बंटी होगी।
  9. उचित आकार के पाइप पर एक पाइप टिप रखें। एक शाखा बिंदु पर आदर्श रूप से एक बड़े, अच्छी तरह से विकसित पोत पर कैम पर आंशिक रूप से बहुलीकृत सेल निलंबन को मजबूर करने के लिए प्लंजर को दबाना।
  10. 6 x 7 सेमी पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के एक चौथाई टुकड़े के साथ खोलने पर मुहर।
  11. एक उपयुक्त प्रत्यारोपण पदनाम के साथ अंडे लेबल।
    नोट: एक समूह के भीतर अंडे की संख्या देशीय टिप्पणियों की सुविधा ।
  12. अंडा को इनक्यूबेटर पर लौटाएं। सुनिश्चित करें कि खोल का उद्घाटन सीधा बैठता है और अंडा सुरक्षित है।
    नोट: अंडे रोटेशन के बिना एक समर्पित अंडे इनक्यूबेटर को वापस किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उच्च पोस्टइम्प्लांट व्यवहार्यता सीओ2 निष्क्रिय और आर्द्रता की निगरानी के लिए एक हाइग्रोमीटर के साथ 37-38 डिग्री सेल्सियस सेल इनक्यूबेटर का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है, जो 50%-80% होना चाहिए।

7. जुगनू लूसिफ़ेरेज़ चिह्नित ट्यूमर की बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग

नोट: यदि प्रत्यारोपित कोशिकाओं को जीन एन्कोडिंग जुगनू लूसिफ़ेरेज या अन्य इमेजिंग कारकों के साथ स्थिर रूप से स्थानांतरित किया गया था, तो परिणामस्वरूप ट्यूमर को बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। एगशेल से उच्च पृष्ठभूमि के कारण बरकरार अंडों पर फ्लोरेसेंस इमेजिंग की सिफारिश नहीं की जाती है। यह एंडपॉइंट विश्लेषण है, क्योंकि खोल का उद्घाटन अस्तित्व को काफी कम कर देता है। ट्यूमर किसी भी समय है कि प्रयोगात्मक जरूरतों और ट्यूमर के विकास की गति के लिए उपयुक्त है पर छवि हो सकती है । हालांकि, औसतन, अंडे 21 दिनों के पोस्टफर्टिलाइजेशन को निकलते हैं। इसलिए, विकास दिवस 18 अवांछित हैचिंग से बचने के लिए एक उपयुक्त अंतिम बिंदु है।

  1. यदि आवश्यक हो, तो इमेजिंग सुविधा के लिए अंडे का परिवहन करें। 10 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन पर टेप अंडे। उन्हें 37.8 डिग्री सेल्सियस (100 डिग्री एफ) अंडे के इनक्यूबेटर में रोटेशन तंत्र के साथ हटा या निष्क्रिय कर दें। परिवहन और इमेजिंग के लिए आर्द्रता महत्वपूर्ण नहीं है।
  2. घुमावदार आईरिस संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे कैम को खोल से दूर धकेलें जब तक कि कैम एल्बुमिन और भ्रूण के साथ फ्लश न हो जाए। व्यापक इत्तला दे दी नमूना संदंश का उपयोग करना, खोल के टुकड़े दूर तोड़ने के लिए ट्यूमर दृश्य के लिए पर्याप्त रूप से खोल खोलने का विस्तार ।
  3. अंडा एल्बुमिन में न्यूनतम 50 माइक्रोन का 30 मिलीग्राम/एमएल डी-लूसिफेरिन इंजेक्ट करें। डी-लूसिफ़ेरिन की एक समान मात्रा को प्रत्यारोपित कोशिकाओं वाले क्षेत्र में कैम की सतह पर या कैम की सतह पर भी किया जा सकता है। यह एक आदर्श संवहनी आपूर्ति के अभाव में इष्टतम बायोल्यूमिनेसेंस सुनिश्चित करता है। 8 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  4. अंडे को एनेस्थेटिज़ करने के लिए अंडे के एल्बुमिन में आइसोफ्लोरीन के 20-50 माइक्रोन इंजेक्ट करें। एक अतिरिक्त 2 मिन के लिए इनक्यूबेट। वैकल्पिक रूप से, अंडे को एक इंडक्शन चैंबर में रखा जा सकता है जिसमें 2-2.5% वाष्पीकृत आइसोफ्लोरीन होसकता है। भ्रूण आंदोलन बंद होने पर पर्याप्त संज्ञाहरण गहराई प्राप्त की जाती है।
    नोट: अंडे को इच्छामृत्यु देने के लिए आइसोफ्लोरीन (100 माइक्रोन) की बड़ी मात्रा का उपयोग किया जा सकता है।
  5. निर्माता के निर्देशों द्वारा निर्धारित उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करके अंडे को बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग डिवाइस और छवि में रखें। इस अध्ययन के लिए 1 मिन के एक्सपोजर टाइम का इस्तेमाल किया गया।
  6. शेष कैम और भ्रूण की छवि के लिए, अंडे को 10-सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में खोलें।
    1. अंडे के बीच के पास अंडे के नीचे दोनों हाथों की उंगलियों और खोल खोलने के दोनों तरफ अंगूठे के साथ अंडे को समझ लें।
    2. धीरे-धीरे उंगलियों के साथ अंडे में दबाने के दौरान अंगूठे के साथ अंडे के दो हिस्सों को अलग कर दें।
    3. जब खोल कैम और भ्रूण से लगभग आधा अलग होता है, तो अंडे को 10-सेमी ऊतक संस्कृति पकवान पर उल्टा फ्लिप करें।
    4. शंख आधा अलग करने के लिए जारी रखें। यदि कैम खोल के अंदर चिपक जाता है, तो धीरे-धीरे सीएएम को खोल से दूर धकेलने के लिए उंगलियों का उपयोग करें।
    5. यदि वांछित हो तो भ्रूण को किसी अन्य पकवान में फ़्लिप किया जा सकता है।
    6. यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त आइसोफ्लोरीन को चरण 7.4 के रूप में प्रशासित किया जा सकता है।

8. ट्यूमर कटाई

नोट: ट्यूमर किसी भी समय काटा जा सकता है कि प्रयोगात्मक जरूरतों और ट्यूमर के विकास की गति के लिए उपयुक्त है । हालांकि, औसतन, अंडे 21 दिनों के पोस्टफर्टिलाइजेशन को निकलते हैं। इसलिए, विकास दिवस 18 अवांछित हैचिंग से बचने के लिए एक उपयुक्त अंतिम बिंदु है।

  1. संदंश के साथ ट्यूमर समझ। कैंची का उपयोग करना (वसंत आईरिस कैंची अच्छी तरह से काम करते हैं) या एक स्केलपेल, कैम से ध्यान से उत्पाद शुल्क ट्यूमर।
  2. यदि ट्यूमर को जुगनू लूसिफ़ेरेज जीन के साथ स्थानांतरित किया गया है, तो मुश्किल से कल्पना ट्यूमर को सफल हटाने को सत्यापित करने के लिए रीइमेजिंग की जा सकती है।
    नोट: एक विशेष प्रयोग के लिए उपयुक्त किसी भी विधि द्वारा उत्पादित ट्यूमर का विश्लेषण किया जा सकता है। ट्यूमर को कैम या चूहों में भी पुन: प्रत्यारोपित किया जा सकता है। ट्यूमर की पहचान की पुष्टि करने के लिए, ट्यूमर को ठीक किया जा सकता है, पैराफिन एम्बेडेड, और हेमेटोक्सिलिन और eosin या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के साथ जांच की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रकार अब तक, हमने अंडाशय, गुर्दे, प्रोस्टेट और मूत्राशय के कैंसर के लिए सफल होने के लिए प्रत्यारोपण की इस विधि को पाया है। प्रत्येक को प्रत्यारोपण के लिए विशिष्ट शर्तों की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया गया था, हालांकि लचीलापन हो सकता है। परीक्षण ट्यूमर प्रकारों में से, ओवेरियन कैंसर का विकास बहुत कम स्पष्ट था और आमतौर पर बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग(चित्रा 1)की सहायता के बिना दिखाई नहीं देता था। हालांकि, कैम की एक कठोरता प्रत्यारोपण के क्षेत्र में संदंश के साथ महसूस किया जा सकता है । यह बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की अनुपस्थिति में संभावित ट्यूमर विकास की पहचान करने में मदद कर सकता है, हालांकि हिटोलॉजी या किसी अन्य उपयुक्त विधि के माध्यम से आगे सत्यापन की आवश्यकता होगी। हमने मानव और मूत्र कोशिका दोनों रेखाओं का सफल एनग्राफमेंट हासिल किया जो वीवो मॉडल(चित्रा 1ए और 1 बी)में अन्य में देखे गए लोगों के अनुरूप मॉर्फोलोजी दिखाते हैं। इसके अलावा, ट्यूमर के टुकड़ों का प्रत्यारोपण संभव था(चित्रा 1सी,नीला तीर ट्यूमर को इंगित करता है)। इस मामले में प्रत्यारोपित ट्यूमर उच्च ग्रेड, मेटास्टैटिक, अंडाशय सीरस कार्सिनोमा के साथ एक मरीज से आया था । जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर रूपात्मक रूप से मूल के अपने ट्यूमर के समान है और इस तरह के साइटोकेराटिन 8/18 के रूप में मानव विशिष्ट प्रोटीन, व्यक्त किया है, कि आसानी से कैम और चिकन भ्रूण ऊतकों से उनके भेदभाव की अनुमति ।

ट्यूमर एनग्राफमेंट और विकास का अनुकूलन करते समय, प्रत्यारोपण के समय उपयुक्त विकास कारक या हार्मोन जोड़े जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, ट्यूमर के आकार में एक सूक्ष्म, तुच्छ वृद्धि (जैसा कि कुल चमक प्रवाह द्वारा मापा जाता है) ID8 कोशिकाओं में देखा गया था जब प्रत्यारोपण(चित्रा 1डी)के समय मानव कूप उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) की तीन इकाइयों (यू) के साथ पूरक किया गया था। ओवेरियन कैंसर के विकास के लिए एफएसएच का चयन ID8 कोशिकाओं में एफएसएच रिसेप्टर की अभिव्यक्ति और आमतौर पर रजोनिवृत्ति के बाद की महिलाओं में पाए जाने वाले एफएसएच के उच्च स्तर से उपजी थी, जो ओवेरियन कैंसर के अधिकांश मामलों का गठन करती हैं। कैम मॉडल की उपयोगिता को बढ़ाने के लिए अन्य कठिन-से-बढ़ने वाले कैंसर प्रकारों के लिए इसी तरह के दृष्टिकोण अपनाए जा सकते हैं। इसके अलावा, एफएसएच को केवल सेल प्रत्यारोपण के समय जोड़ा गया था। विकास कारक या हार्मोन की भरपाई उचित अंतराल पर नॉनस्टिक रिंग में माध्यम में योजक की एक उचित मात्रा में पाइपिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है, जो प्रभाव को बढ़ा सकता है ।

गुर्दे के कैंसर के लिए, 2 x 106 स्पष्ट सेल गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा कोशिकाओं जैसे RENCA के रूप में स्थापित सेल लाइनों से प्रत्यारोपण, तेजी से, मजबूत ट्यूमर गठन का उत्पादन किया, हालांकि कम सेल खुराक भी इस्तेमाल किया जा सकता है(चित्रा 2ए,10 दिन postimplantation) । जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर रूपात्मक रूप से वीवो मॉडल28में मानक माउस के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के समान थे । जुगनू लूसिफ़ेरेसे की अनुमति बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के साथ चिह्नित RENCA कोशिकाओं का प्रत्यारोपण। प्राथमिक मानव ट्यूमर भी प्रत्यारोपित किया जा सकता है। ट्यूमर के टुकड़े कायम रहे और महत्वपूर्ण विकास दिखाए बिना वास्कुल्चर की भर्ती की। एक प्राथमिक, स्पष्ट सेल गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा से उत्पन्न पचाने वाली कोशिकाओं का प्रत्यारोपण, जिसे विट्रो में विस्तारित किया गया था, हालांकि, स्थापित सेल लाइनों(चित्रा 2बी)के समान वृद्धि हुई। गुर्दे सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं को नॉनस्टिक रिंग विधि या गैरस्टिक रिंग के बिना विधि का उपयोग करके वरीयता दी जा सकती है।

कैम एनग्राफमेंट(चित्रा 3)के लिए कई मानव और मूत्र प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों का परीक्षण किया गया था। प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ी जब 2 x 106 कोशिकाओं को नॉनस्टिक रिंग का उपयोग करके प्रत्यारोपित किया गया था। परिणामस्वरूप ट्यूमर का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन प्रत्येक सेल लाइन के लिए अपेक्षाओं के अनुरूप था। इसके अतिरिक्त, जुगनू लूसिफ़ेरेसे के साथ चिह्नित कोशिकाओं का प्रत्यारोपण बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग(चित्रा 3ए)के साथ ट्यूमर पहचान की अनुमति दी जाती है।

मूत्राशय कैंसर की स्थापना की सेल लाइनों और प्राथमिक मानव ऊतक के टुकड़ों(चित्र4)से कैम मॉडल में स्थापित किया गया था । सेल लाइनों अच्छी तरह से वृद्धि हुई जब नॉनस्टिक अंगूठी(चित्रा 4ए और 4B)के बिना 2 x 106 कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित, हालांकि अंगूठी के साथ प्रत्यारोपण सफल रहा था । प्राथमिक मानव ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों से प्रत्यारोपित किया जा सकता है(चित्रा 4सी)। प्रस्तुत मामला उच्च ग्रेड, गैर-मांसपेशी-आक्रामक, यूरोथेलियाल कार्सिनोमा वाले रोगी से उत्पन्न हुआ। चल रहे ट्यूमर पाचन अनुकूलन के कारण पचाई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण अभी तक नहीं किया गया है। परिणामस्वरूप कैम ट्यूमर की कैंसर कोशिकाओं ने मूल ट्यूमर की आकृति विज्ञान को बनाए रखा, लेकिन एक परिवर्तित स्ट्रोमल घटक के साथ। ट्यूमर विकास गुर्दे सेल कार्सिनोमा और प्रोस्टेट कैंसर के लिए की तुलना में कम था, हालांकि अभी भी आसानी से दिखाई ।

अंत बिंदु पर व्यवहार्य, परखे वाले अंडों की एक उच्च संख्या सुनिश्चित करने के लिए, अंडे को इनक्यूबेटिंग और खोलते समय देखभाल की जानी चाहिए। यदि इनक्यूबेटर की स्थिति प्रत्यारोपण से पहले या बाद में उप-इष्टतम हैं, तो भ्रूण व्यवहार्यता से समझौता किया जा सकता है। यदि महत्वपूर्ण भ्रूणीय मृत्यु होती है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार इनक्यूबेटर स्थितियों को परेशान करना। हमारे अनुभव में, तापमान और आर्द्रता स्थिरता उनके सटीक मूल्यों की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण प्रतीत होती है। इसलिए, हमने पाया कि एक संशोधित, सेल-संस्कृति में टीका लगाने वाले अंडों को इनक्यूबेटिंग, सीओ2 इनक्यूबेटर ने छोटे, समर्पित अंडे इनक्यूबेटर में अंडों को बनाए रखने पर बेहतर व्यवहार्यता हासिल की, जिन्हें आर्द्रता को नियंत्रित करने वाले पानी की भरपाई के लिए अधिक बार खोलने की आवश्यकता होती है। जिस आवृत्ति के साथ ट्यूमर परीक्षा के लिए टीका लगाने वाले अंडे निकाले जाते हैं, उसे कम करने से भ्रूण व्यवहार्यता में भी वृद्धि हो सकती है।

कैम प्रत्यारोपण की एक अतिरिक्त चिंता टीका पर कैम की अखंडता है। यदि सीएएम खोल खोलने के बाद बरकरार नहीं है, तो नॉनस्टिक रिंग और प्रत्यारोपित कोशिकाएं भ्रूण के एल्बुमिन में डूब जाएंगी (चरण 2.12 के बाद नोट देखें)। इसके कारण कैंसर सेल फैलाव होता है। कुछ ट्यूमर अभी भी फार्म का हो सकता है, लेकिन कैंसर है कि महत्वपूर्ण विकास और अस्तित्व ऐसे अंडाशय के कैंसर के रूप में पड़ोसी कैंसर की कोशिकाओं से संकेत प्राप्त, मज़बूती से ऐसी स्थितियों के तहत ट्यूमर फार्म नहीं होगा । यदि प्रत्यारोपण के लिए नॉनस्टिक छल्ले का उपयोग किया जाता है, तो कैम की विफलता को एल्बमिन में अंगूठी के डूबने से पहचाना जा सकता है। यह उन मामलों से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए जिनमें अंगूठी और प्रत्यारोपित कोशिकाओं को भ्रूणीय आंदोलन द्वारा अंडे के नीचे ले जाया गया था। उन मामलों में, अंगूठी कैम और खोल के नीचे के बीच पाया जाएगा । भ्रूणआंदोलन को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, रिंग प्लेसमेंट से भ्रूण के लिए प्रत्यारोपित कोशिकाओं को बाधित करना और मुश्किल हो सकता है । कदम २.७ में उत्पन्न हवा की जेब के किनारों पर रखा छल्ले अधिक क्षेत्र के केंद्र में रखा उन लोगों की तुलना में भ्रूण द्वारा स्थानांतरित होने की संभावना है ।

Figure 1
चित्रा 1: अंडाशय के कैंसर से प्रतिनिधि ट्यूमर विकास। ओवेरियन कैंसर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित शामिल हैं:(ए)मानव SKOV3 सेल लाइन,(बी)मूत्र ID8 सेल लाइन, और(सी)प्राथमिक ट्यूमर । प्रतिनिधि हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के साथ प्रस्तुत किया जाता है, जैसा कि उचित है। कैम ट्यूमर के लिए एक प्राथमिक ट्यूमर टुकड़ा(सी)हेमेटोक्सीलिन और दोनों कैम ट्यूमर और प्राथमिक ट्यूमर के eosin धुंधला के प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप शामिल हैं, साइटोकेराटिन 8/18 (सीके 8/18) के साथ जिसके परिणामस्वरूप कैम ट्यूमर का धुंधला । पहले पैनल में नीला तीर ट्यूमर को इंगित करता है। (घ)3U एफएसएच के साथ और बिना ID8 प्रत्यारोपण के ट्यूमर का आकार, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (एन = 3 अनुपचारित के लिए और एफएसएच-पूरक के लिए एन = 4) के परिणामस्वरूप कुल प्रवाह के रूप में गणना की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्पष्ट सेल गुर्दे सेल कार्सिनोमा से प्रतिनिधि ट्यूमर विकास। ट्यूमर के प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप(ए)मूत्र गुर्दे सेल कार्सिनोमा सेल लाइन, RENCA, या(बी)सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक पचा मानव प्राथमिक ट्यूमर से प्राप्त । (बी)में एक्साइज्ड ट्यूमर से सटे माप पैमाने पर 1 मिमी निशान दिखाई देते हैं। इसी हिस्टोलॉजी इन(ए)और(बी)हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला दिखाता है। (ए)में, जुगनू-लूसिफ़ेरेज़-चिह्नित RENCA कोशिकाओं के प्रतिनिधि बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग को भी दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों से प्रतिनिधि ट्यूमर विकास। रिप्रेजेंटेटिव ट्यूमर और हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों(ए)सीडब्ल्यूआर और(बी)सी 4-2 के प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप मूत्र सेल लाइन(सी)MyC-CaP के साथ । जुगनू लूसिफ़ेरास से परिणामी ट्यूमर की बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग(ए)में दिखाया गया है। एक्साइज्ड ट्यूमर से सटे माप पैमाने पर 1 मिमी निशान दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मूत्राशय के कैंसर से प्रतिनिधि ट्यूमर विकास। स्थापित मानव मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइनों(ए)एचटी-1376,(बी)टी-24, और(सी)प्राथमिक मानव मूत्राशय ट्यूमर के प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप प्रतिनिधि ट्यूमर। (सी),हेमैटोक्सीलिन और जिसके परिणामस्वरूप कैम ट्यूमर और प्राथमिक ट्यूमर के eosin धुंधला दिखाया जाता है । एक्साइज्ड ट्यूमर से सटे माप पैमाने पर 1 मिमी निशान दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कैम मॉडल का उपयोग करके ट्यूमर विस्तार और engraftment वीवो पशु मॉडल में मौजूदा की तुलना में अधिक तेजी से और सीधे नमूदार ट्यूमर विकास की अनुमति देता है। इसके अलावा, उपकरणों की प्रारंभिक खरीद पूरी होने के बाद लागत काफी कम हो जाती है, खासकर जब इम्यूनोसमझौता चूहों की लागत की तुलना में। चिकन भ्रूण की प्रारंभिक, इम्यूनोसमझौता स्थिति आसानी से मानव और मूत्र ऊतक के engraftment की अनुमति देती है। यहां तक कि इन ताकत के साथ, कैम मॉडल की सीमाएं हैं। कम समय है कि एक लाभ हो सकता है भी एक हानि हो सकती है अगर दीर्घकालिक उपचार अध्ययन की आवश्यकता है । कैम मॉडल की इम्यूनोसमझौता/प्रतिरक्षा सहिष्णु स्थिति ट्यूमर-प्रतिरक्षा बातचीत के अध्ययन को जटिल बना सकती है । इन अध्ययनों के लिए, ब्याज की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का coimplantation आवश्यक हो सकता है, संभवतः प्रतिरक्षा डिब्बे की भरपाई के साथ। इसके अलावा, हालांकि सभी ट्यूमर प्रकार हम कैम मॉडल में engraft प्रस्तुत किया, वे विकास की डिग्री बदलती के साथ ऐसा करते हैं । उदाहरण के लिए, गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा तेजी से बड़े ट्यूमर बनाती है, लेकिन ओवेरियन कैंसर ट्यूमर बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग की सहायता के बिना कल्पना करना मुश्किल है। ट्यूमर के विकास और गति के लिए एक विशेष ट्यूमर प्रकार के लिए मूल्यांकन करने के लिए निर्धारित अगर कैम एक उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल होगा की आवश्यकता होगी ।

सफल ट्यूमर engraftment प्रोटोकॉल के विशिष्ट चरणों के सावधान पूरा करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, अंडे को आदर्श परिस्थितियों में इनक्यूबेटेड करने की आवश्यकता होती है ताकि इन्ग्राफमेंट से पहले इष्टतम भ्रूण अस्तित्व और सीएएम गठन हो सके। बैचों में प्राकृतिक परिवर्तनशीलता के कारण, हम विशिष्ट अंडे आपूर्तिकर्ता से अतिरिक्त अंडे प्राप्त करने का सुझाव देते हैं। हमने यह भी पाया है कि कूलर, रेनियर मौसम अंडे में फंगल ग्रोथ का कारण बन सकता है । गीले मौसम के दौरान, एंडपॉइंट पर पर्याप्त पैदावार प्राप्त करने के लिए अधिक अंडे को एन्ग्राफेट करने की आवश्यकता हो सकती है। यह मौसमी भिन्नता क्षेत्र-विशिष्ट होने की संभावना है । सफल ट्यूमर एनग्राफमेंट के लिए पर्याप्त कैम गठन आवश्यक है। खोलने पर खोल से जुड़े सीएएम शेष के किसी भी संकेत को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए। यदि पहले बैच खोलते समय कई अंडे बरकरार सीएएम में विफल रहते हैं, तो हम कम से कम 1 अतिरिक्त दिन के लिए शेष अंडे के उद्घाटन में देरी की सलाह देते हैं।

यदि खराब व्यवहार्यता या भ्रष्टाचार प्राप्त कर रहे हैं, कई कदम गलती पर हो सकता है । सबसे पहले, आपूर्तिकर्ता से भ्रूण व्यवहार्यता खराब हो सकती है। वायु कोशिका और दृश्यमान वास्कुलचर की अनुपस्थिति एक अव्यवहार्य अंडे को इंगित करती है। कभी-कभी, भ्रूण आंदोलन की कल्पना व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए की जा सकती है। सबसे पहले, हालांकि, यह सुनिश्चित करें कि ताजा बैटरी अंडे के मोमबत्ती में हैं, क्योंकि दृश्य के लिए एक मजबूत प्रकाश की आवश्यकता होती है। फ्लोट टेस्ट व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है (कई तरह के निर्देश और वीडियो ऑनलाइन उपलब्ध हैं)। खराब व्यवहार्यता के लिए एक और संभव स्पष्टीकरण इनक्यूबेटर है । एक स्वतंत्र हाइग्रोमीटर और थर्मामीटर का उपयोग करना, सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स सटीक और स्थिर हैं। इनक्यूबेटर के लिए निर्माता के निर्देशों में उचित सेटिंग्स का आकलन करने के लिए विस्तृत समस्या निवारण निर्देश शामिल होने चाहिए। अनुचित इनक्यूबेटर सेटिंग्स भी कैम विकास से समझौता कर सकती है। टेप और/या एक मार्कर का उपयोग करना, निर्धारित अगर अंडा रोटेटर वास्तव में अंडे कताई है । यदि नॉनस्टिक छल्ले engrafted अंडे के एक उच्च अनुपात में एल्बुमिन में सिंक, तो कैम पर्याप्त रूप से विकसित नहीं किया । अंत में, हमने पाया है कि एंग्बेड़ा अंडे की लगातार जांच, तापमान और आर्द्रता में उतार-चढ़ाव के कारण, प्रत्यारोपण के बाद की व्यवहार्यता में कमी आ सकती है। यदि प्रत्यारोपित अंडे शुरू में व्यवहार्य हैं, लेकिन क्षमता engraftment अवधि के दौरान कम हो जाती है, अंडे कम बार जांच की जानी चाहिए । व्यवहार्यता में यह कमी प्रत्यारोपण के बाद गलत या अनुचित इनक्यूबेटर सेटिंग्स के कारण भी हो सकती है।

नए सेल प्रकार के लिए इस विधि को अनुकूलित करते समय, कई कारकों को नियंत्रित किया जा सकता है। पहला सेल नंबर है। हम आम तौर पर सेल लाइनों से 5 x 105-2x 106 कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करते हैं। प्रत्यारोपित ट्यूमर के टुकड़े आम तौर पर प्रत्येक पक्ष पर 2-5 मिमी होते हैं। इन राशियों को एनग्राफमेंट या आकार में सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, हमने पाया है कि ट्यूमर विकास एक निश्चित सीमा से ऊपर कम हो जाता है, जो सेल प्रकार निर्भर है। अतिरिक्त engraftment मापदंडों में गैर-स्टिक रिंग की उपस्थिति या अनुपस्थिति शामिल है। यह विकल्प आम तौर पर इस आधार पर बनाया जाता है कि क्या अंगूठी एंडपॉइंट विश्लेषण में बाधा डालेगी, हालांकि यह सफल इन्ग्राफमेंट को भी प्रभावित कर सकती है। नॉनस्टिक रिंग की उपस्थिति भी वांछित अंतराल पर मध्यम के साथ नवजात भ्रष्टाचार को कवर करने के लिए संवहनी भर्ती से पहले अस्तित्व में सुधार की अनुमति हो सकती है, अगर ऐसा वांछित । एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स प्रकार, एकाग्रता और मध्यम जिसमें मैट्रिक्स पतला होता है, का चुनाव भी एनग्राफमेंट को प्रभावित कर सकता है। विकास कारकों या हार्मोन के अलावा ट्यूमर लेने की दर या आकार में और सुधार हो सकता है। योजक और सांद्रता का चयन विशिष्ट सेल प्रकार के लिए उपयुक्त होगा और प्रयोग में हस्तक्षेप नहीं करने के आधार पर किया जाना चाहिए। यदि एक नॉनस्टिक रिंग का उपयोग किया जाता है तो इनमें अंतराल पर मंगाए जाने की क्षमता भी होगी।

इस मॉडल प्रणाली के भविष्य के अनुप्रयोगों की परिकल्पना पर निर्भर करता है परीक्षण किया जाना है। उदाहरण के लिए, इन ट्यूमर ग्राफ्ट का उपयोग ट्यूमर के आकार को कम करने या ट्यूमर की उपआबादी को कम करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोणों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। मेजबान ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट से कोशिकाओं के साथ सह-प्रत्यारोपण ट्यूमर विकास और उपचार प्रतिरोध सहित विभिन्न मापदंडों पर इन कोशिकाओं के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति दे सकता है। यह मॉडल इम्यूनोसमझौता किए गए पशु मॉडलों में विद्वेष स्थापित करने से पहले प्राथमिक मानव ट्यूमर का विस्तार करने के अवसर के रूप में भी काम कर सकता है। कैम एनग्राफमेंट के प्रारंभिक अनुकूलन शायद ट्यूमर को मूत्र मॉडल में दर लेने की सुविधा प्रदान कर सकता है। इन आवेदनों का परीक्षण अभी बाकी है, लेकिन आगे की खोज वारंट ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस विधि पर प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए डॉ फुयुहिको तमनोई और बिन्ह वु का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । डॉ ईवा कोजिओलेक के साथ विचार-विमर्श इस दृष्टिकोण को अनुकूलित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और इसकी बहुत सराहना की गई है । यह काम निम्नलिखित स्रोतों से धन के बिना संभव नहीं होता: तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (27FT-0023, एसीएस के लिए), रक्षा विभाग (DoD) अंडाशय कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम उच्च प्रभाव पायलट पुरस्कार (27IR-0016), और UCLA संस्थागत समर्थन, जिसमें जेसीसीसी बीज अनुदान (एनसीआई/एनआईएच पी30सीए016042) और अनुसंधान के लिए कुलपति के कार्यालय से एलडब्ल्यू को 3आर अनुदान शामिल है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings The O-Ring Store TEF010 Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2 ATCC CRL-3314 Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1 CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) Novus Biologicals NBP2-44929-0.02mg Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length Roboz Surgical RS6703 This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18 This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) AA Lab Eggs Inc. N/A A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376 ATCC CRL-1472 Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D-NONE-1102-1588-1357 Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8 Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler Incubator Warehouse 1102 Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips World Precision Instrument 15915 This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane Clipper Distributing 0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free Corning 354248 Extracellular matrix solution
MyC-CaP ATCC CRL-3255 Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller Drummond Scientific 4-000-101 Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles BD 305196 This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA ATCC CRL-2947
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13 This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3 ATCC HTB-77 Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps Electron Microscopy Sciences 72914 This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length United Scientific Supplies GRPL06 This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24 ATCC HTB-4 Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter Corning 353803 This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017 This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  2. Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
  3. Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
  4. Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
  5. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
  6. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  7. Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  8. Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
  9. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  10. Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  11. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  12. Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
  13. Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
  14. Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
  15. Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
  16. Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
  17. Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
  18. Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
  19. Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
  20. Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
  21. Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
  22. Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
  23. Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
  24. Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
  25. Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
  26. Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
  27. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  28. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).

Tags

कैंसर रिसर्च इश्यू 155 चिकन कोरियोएलनोइक झिल्ली कैम डिजीज मॉडल एनिमल हेट्रोग्राफ्स मरीज से व्युत्पन्न विद्वेष प्रत्यारोपण हेट्रोटोटोपिक ओवेरियन नियोप्लाज्म्स यूरोलॉजिक नियोप्लाज्म्स ओवो में
स्त्री रोग और यूरोलॉजिकल कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलांटोइक झिल्ली का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu,… More

Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. J. Vis. Exp. (155), e60651, doi:10.3791/60651 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter