1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템
Summary
여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.
Abstract
사후 전사 조절을 연구하는 것은 주어진 메신저 RNA (mRNA)의 변조와 세포 항상성 및 대사에 미치는 영향을 이해하는 데 기본적입니다. 실제로, 전사체 발현의 변동은 번역 효율성과 궁극적으로 전사체의 세포 활성을 수정할 수 있다. 몇몇 실험적인 접근은 이 방법의 몇몇이 사후 전사 변조의 적당한 연구 결과 방지하는 한계가 있더라도 mRNA의 반감기를 조사하기 위하여 개발되었습니다. 프로모터 유도 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 있는 유전자를 발현할 수 있다. 이 방법은 세포 항상성을 방해하지 않고 임의의 실험 조건 하에서 주어진 mRNA의 반감기 추정을 허용한다. 이 방법의 한 가지 주요 단점은 기존의 형질 감염 기술에 매우 저항력이있는 고립 된 1 차 세포에서이 기술의 사용을 제한하는 트랜스 펙트 세포의 필요성입니다. 1 차적인 문화에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 세포 및 분자 생물학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 1 차적인 폐포 세포의 유일한 특성 그리고 표현형은 이 세포에 있는 관심 있는 유전자의 사후 전사 변조를 공부하는 것이 필수적입니다. 따라서, 우리의 목표는 1 차적인 배양에 있는 폐포 상피 세포에 있는 관심있는 mRNAs의 사후 전사 변조를 조사하기 위하여 새로운 공구를 개발하는 것이었습니다. 우리는 1 차적인 폐포 상피 세포로 전사로 통제된 plasmid 발현 시스템을 삽입하기 위하여 빠르고 능률적인 과도 형질 감염 프로토콜을 디자인했습니다. 이 복제 전략은 바이러스 성 에피토프를 사용하여 구문에 태그를 붙이면 내인성 mRNAs의 구성발식을 쉽게 차별할 수 있습니다. 수정된 ΔΔ 정량화 주기(Cq) 방법을 사용하여, 전사체의 발현은 그 반감기를 측정하기 위해 상이한 시간 간격으로 정량화될 수 있다. 우리의 데이터는 1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 각종 병리생리학 조건에 있는 사후 전사 적 조절을 공부에 있는 이 새로운 접근의 효율성을 보여줍니다.
Introduction
mRNA의 반감기를 결정하기 위하여 몇몇 기술이 개발되었습니다. 표지된 mRNAs를 이용하는 펄스 추적 붕괴 기술은, 최소한의 세포 소요를 가진 mRNAs의 큰 풀의 동시 평가를 허용합니다. 그러나, 이러한 접근법은 단일 유전자 전사체의 반감기에 대한 직접적인 추정을 허용하지 않으며 성장 인자, ROS, alarmins, 또는 염증1을가진 자극에 따른 mRNA의 사후 전사 변조를 연구하기 위해 구현될 수 없다.
actinomycin D 및 α-amanitin과 같은 전사 억제제의 사용은 시간이 지남에 따라 mRNA 분해 역학을 측정하는 비교적 간단한 방법입니다. 이전 기술에 비해이 방법의 한 가지 주요 장점, (즉, 펄스 추적) 직접 주어진된 성적 증명서의 반감기를 추정 하 고 다른 치료 그것의 저하 역학에 영향을 미칠 수 있는 방법을 비교 하는 능력에 의존. 그러나, 세포 생리학에 대한 전사 억제제의 유의한 해로운 영향은 접근법2의주요 단점을 나타낸다. 실제로, 이들 약물을 사용하는 전체 세포 전사체의 억제는 마이크로RNA(miRNA)와 같은 mRNA 안정성에 관여하는 주요 원소의 합성을 교란시키는 부정적인 부작용뿐만 아니라 MRNA 결합 단백질의 발현 및 합성뿐만 아니라 mRNA 분해 및 안정성에 중요한 영향을 미친다. 이 약에 의하여 유전자 전사의 가혹한 교란은 그러므로 실제로 전사체의 분해 곡선을 수정할 수 있었습니다.
프로모터 유도 시스템은 특정 mRNA의 반감기를 측정하는 제3 접근법을 나타낸다. 이 방법은 전사 억제제와 유사한 방식으로 특정 mRNA의 분해를 측정합니다. 유도 시스템의 2가지 유형이 자주 사용된다: 혈청 유도 c-fos 프로모터3 및 Tet-Off 유도시스템4. c-fos 시스템으로, 세포에 유독할 수 있는 전사 억제제의 사용은 필요하지 않습니다. 그러나, 이 방법은 세포 주기 동기화가 필요하며, 이는 상 간5동안 전사체의 실제 안정성의 평가를 방지한다. 대조적으로, Tet-Off 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 유전자(GOI)의 강력한 발현을 허용한다. 이 시스템은 작동하기 위하여 세포로 cotransfected되어야 하는 2개의 요소의 존재를 요구합니다. 제1 플라스미드(pTet-Off)는 바이러스 성 단백질 HSV VP16로부터 3개의 전사 트랜스활성화 도메인으로 융합된 원핵핵억제제 TetR(대장균으로부터)으로 구성된 혼종 합성 전사 인자인 tTA-Adv를 발현한다. 상기 GOI는 테토오 연산자 서열의 7회 반복으로 융합된 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 최소 서열을 포함하는 합성 프로모터(PTight)의제어 하에 pTRE-Tight 플라스미드내로 복제된다. P타이트의 유전자 하류의 전사는 tetO와 의 TetR의 상호작용에 의존한다. 테트라 사이클린 또는 그 유도체, 독시 사이클린이있는 경우, TetR 억압자는 tetO 연산자에 대한 친화력을 잃어 전사4의중단으로 이어진다. Tet-Off 시스템의 특성은 진핵 세포에서 의 핵경상 조절 서열의 부재에 이차적인 잠재적 인 pleiotropic 효과를 피하면서 진핵 세포에서 특정 mRNA 발현의 연구에 이상적인모델6. 일반적으로, 이중으로 안정적인 Tet-Off 세포주(HEK 293, HeLa 및 PC12)는 조절가능한 유전자발현에편리하게 접근할 수 있도록 조절기 및 반응 플라스미드의 사본을 통합하기 위해 이 시스템과 함께 사용된다7,8,9.
배양에서 폐포 상피 세포의 몇몇 모형은 폐포 상피의 세포 그리고 분자 생물학을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 수년 동안, 연구자들은 인간 또는 설치류1차 세포10,11뿐만 아니라 인간 A549 또는 쥐 RLE-6TN세포(12,13)와같은 불멸의 세포주를 광범위하게 활용하였다. 그들은 일반적으로 덜 증식 하 고 배양 하 고 transfect, 1 차 배양에서 폐포 상피 세포 기능 및 생리 및 병 리 조건에서 폐 포 상피의 기능 및 기능 장애의 연구에 대 한 골드 표준 남아. 실제로, A549 세포와 같은 불멸화된 세포주는 1차 세포의 복합적인 특성 및 표현형을 나타내지 않는 반면, 1차 배양에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 주요 특성을 재구성하는 반면, 특히 편광 및 단단한장벽(14,15)을형성하는 능력이 있다. 불행히도, 이들 세포는 리포솜을 활용하는 것과 같은 종래의 형질감염 기술에 매우 내성이 있어 Tet-Off와 같은 프로모터 유도 시스템의 사용이 매우 어렵다.
mRNAs의 후전사 변조는전사체(16)의유전자 발현을 빠르게 조절하는 가장 효과적인 방법 중 하나이다. mRNA 3′ 번역되지 않은 영역 (3′ UTR)은 이 기계장치에 있는 중요한 역할을 합니다. 5′ UTR과 달리 3′ UTR의 길이와 유기체의 세포 및 형태학적 복잡성 사이에 기하급수적인 상관 관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 상관관계는 mRNA 코딩 영역과 같은 3′ UTR이 진화17전반에걸쳐 점점 더 복잡한 후전사 변조를 허용하도록 자연선택을 거쳤음을 시사한다. 3′ UTR은 전사체의 안정성 및 번역에 영향을 미치는 단백질 및 miRNAs에 대한 여러 결합 부위를 포함합니다.
본 작품에서는 전사체 안정성을 제어하기 위한 GOI의 3′ UTR에서 고도로 보존된 도메인의 역할을 조사하는 도구를 개발했습니다. 우리는 폐포 상피 생리학에 중요한 역할을 하는 상피 나트륨 채널, 알파 소단위(αENaC)에 초점을 맞췄습니다18. 1 차 적인 배양에서 폐포 상피 세포는 성공적으로 다른 프로토콜과 전사 억제제의 사용에 비해 세포 생리학 및 신진 대사에 최소한의 영향을 미치는 시스템으로 mRNA 안정성에서 3’UTR의 역할의 연구를 허용하는 Tet-Off 시스템의 두 가지 구성 요소로 과도하게 형질 감염되었다. 비내인성 발현 에피토프(V5)를 사용하여 내인성 유전자의 발현과 GOI의 발현을 분화하기 위한 복제 전략이 개발되었다. 반응 및 조절 플라스미드는 피펫 전기화 기술을 사용하여 폐포 상피 세포로 옮겨졌다. 이어서, 전사체의 발현은 상이한 시간 간격으로 독시사이클린으로 세포를 배양시킴으로써 측정하였다. 전사체의 반감기는 정규화를 위해 형질감염된 tTA-Ad mRNA 생성자를 사용하여 변형된 Cq 방법을 사용하여 RT-qPCR에 의해 평가되었다. 우리의 프로토콜을 통해, 우리는 다른 조건에서 성적 증명서의 사후 변조를 공부하고 더 자세히 번역되지 않은 영역의 참여를 정의하기위한 편리한 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1차 배양에서 폐포 상피 세포의 낮은 형질감염속도는 이들 세포에서 mRNA 안정성을 평가하기 위해 Tet-Off 시스템의 사용에 대한 심각한 제한이었다. 그러나, 이러한 한계는 파이펫 전기개공에 의해 극복되었고, 25-30% 형질감염 효율을 허용하였다(도1 및 도 3)26.
전사체 안정성의 측정은 주어진 mRNA의 변조와 세포 항상…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
프랜시스 미뉴올트는 퀘벡 호흡기 건강 네트워크와 캐나다 보건 연구소(CIHR) 폐 훈련 프로그램, FRSQ 학생, 그리고 학부 데 에투데스 수페리어(Faculté des Études Supérieures) 학생의 지원을 받았습니다. 박사 후, 몬트리올 대학교. 이 작품은 임상 연구에서 Gosselin-Lamarre 의자와 건강 연구의 캐나다 연구소 [YBMOP-79544]에 의해 지원되었다.
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
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