Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias
Summary
Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.
Abstract
El estudio de la regulación posttranscripcional es fundamental para entender la modulación de un ARN mensajero (ARNm) dado y su impacto en la homeostasis celular y el metabolismo. De hecho, las fluctuaciones en la expresión de transcripción podrían modificar la eficiencia de la traducción y, en última instancia, la actividad celular de una transcripción. Se han desarrollado varios enfoques experimentales para investigar la vida media del ARNm, aunque algunos de estos métodos tienen limitaciones que impiden el estudio adecuado de la modulación posttranscripcional. Un sistema de inducción promotor puede expresar un gen de interés bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite la estimación de la vida media de un ARNm dado bajo cualquier condición experimental sin perturbar la homeostasis celular. Un inconveniente importante de este método es la necesidad de transfectar las células, lo que limita el uso de esta técnica en células primarias aisladas que son altamente resistentes a las técnicas de transfección convencionales. Células epiteliales alveolares en el cultivo primario se han utilizado ampliamente para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Las características únicas y el fenotipo de las células alveolares primarias hacen que sea esencial estudiar las modulaciones posttranscripcionales de genes de interés en estas células. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar una herramienta novedosa para investigar las modulaciones posttranscripcionales de los ARNm de interés en las células epiteliales alveolares en el cultivo primario. Diseñamos un protocolo de transfección transitoria rápido y eficiente para insertar un sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción en células epiteliales alveolares primarias. Esta estrategia de clonación, utilizando un epítopo viral para etiquetar la construcción, permite la fácil discriminación de la expresión de la construcción a partir de la de los ARNm endógenos. Mediante el uso de un método de ciclo de cuantificación (Cq) modificado, la expresión de la transcripción se puede cuantificar en diferentes intervalos de tiempo para medir su vida media. Nuestros datos demuestran la eficiencia de este enfoque novedoso en el estudio de la regulación posttranscripcional en diversas condiciones fisiopatológicas en células epiteliales alveolares primarias.
Introduction
Se han desarrollado varias técnicas para determinar la vida media de los ARNm. La técnica de descomposición de la persecución por pulsos, que utiliza ARNm etiquetados, permite la evaluación simultánea de una gran piscina de ARNm con mínima perturbación celular. Sin embargo, este enfoque no permite una estimación directa de la vida media de una sola transcripción genética y no se puede implementar para estudiar la modulación posttranscripcional de un ARNm después de la estimulación con factores de crecimiento, ROS, alarminas o inflamación1.
El uso de inhibidores de la transcripción, como la actinomicina D y la amanitina, es un método relativamente simple para medir la cinética de degradación del ARNm a lo largo del tiempo. Una ventaja principal de este enfoque sobre el de las técnicas anteriores , (es decir, la persecución por pulsos) se basa en la capacidad de estimar directamente la vida media de una transcripción determinada y comparar cómo diferentes tratamientos podrían afectar su cinética de degradación. Sin embargo, el impacto nocivo significativo de los inhibidores de la transcripción en la fisiología celular representa un inconveniente importante del enfoque2. De hecho, la inhibición de todo el transcriptoma celular con estos fármacos tiene el efecto secundario negativo de perturbar la síntesis de elementos clave involucrados en la estabilidad del ARNm, como los microARN (miRNAs), así como la expresión y síntesis de proteínas de unión al ARN, que son importantes para la degradación y estabilidad del ARNm. Por lo tanto, la perturbación severa de la transcripción génica por estos fármacos podría modificar artefrealmente las curvas de degradación de las transcripciones.
El sistema de inducción del promotor representa un tercer enfoque para medir la vida media de un ARNm específico. Este método mide la degradación de un ARNm específico de una manera similar a los métodos que utilizan inhibidores de la transcripción. Con frecuencia se utilizan dos tipos de sistemas de inducción: el promotor c-fos inducido por suero3 y el sistema inducible Tet-Off4. Con el sistema c-fos, no es necesario el uso de inhibidores de transcripción que pueden ser tóxicos para la célula. Sin embargo, este método requiere la sincronización del ciclo celular, que impide la evaluación de la estabilidad real de una transcripción durante la interfase5. Por el contrario, el sistema Tet-Off permite la fuerte expresión del gen de interés (GOI) bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requiere que la presencia de dos elementos que deben ser cotransinfectados en la célula sean funcionales. El primer plásmido (pTet-Off) expresa la proteína reguladora tTA-Adv, un factor de transcripción sintética híbrida compuesto por el represor prokariotate TetR (de Escherichia coli) fusionado a tres dominios de transactivación de transcripción de la proteína viral HSV VP16. El GOI se clona en el plásmido pTRE-Tight bajo el control de un promotor sintético (PTight),que comprende la secuencia mínima del promotor del citomegalovirus (CMV) fusionado a siete repeticiones de la secuencia del operador tetO. La transcripción del gen aguas abajo de PTight depende de la interacción de TetR con tetO. En presencia de tetraciclina o su derivado, doxiciclina, el represor TetR pierde su afinidad por el operador tetO, lo que lleva a un cese de la transcripción4. Las características del sistema Tet-Off lo convierten en un modelo ideal para el estudio de la expresión de ARNm específica en células eucariotas evitando al mismo tiempo posibles efectos pleiotrópicos que son secundarios a la ausencia de secuencias reguladoras procariotas en la célula eucariota6. Por lo general, las líneas celulares Tet-Off doblemente estables (HEK 293, HeLa y PC12) se utilizan con este sistema para integrar copias del regulador y plásmidos de respuesta para un acceso conveniente a la expresión génica controlable7,8,9.
Varios modelos de células epiteliales alveolares en cultivo se han utilizado para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Durante años, los investigadores han utilizado ampliamente células primarias humanas o roedores10,11, así como líneas celulares inmortalizadas como células Humanas A549 o ratas RLE-6TN12,13. Aunque generalmente son menos proliferativas y más difíciles de cultivar y transfectar, las células epiteliales alveolares en el cultivo primario siguen siendo el estándar de oro para el estudio de la función y disfunción del epitelio alveolar en condiciones fisiológicas y patológicas. De hecho, las líneas celulares inmortalizadas como las células A549 no presentan las características complejas y fenotipos de las células primarias, mientras que las células epiteliales alveolares en el cultivo primario recapitulan las principales propiedades del epitelio alveolar, en particular la capacidad de formar una barrera polarizada y estrecha14,15. Desafortunadamente, estas células son muy resistentes a las técnicas de transfección convencionales, como las que utilizan liposomas, haciendo muy difícil el uso de un sistema inducido por el promotor como Tet-Off.
La modulación posttranscripcional de los ARNM es uno de los métodos más eficaces para modular rápidamente la expresión génica de una transcripción16. La región no traducida del ARNM 3 (3′ UTR) desempeña un papel importante en este mecanismo. Se ha demostrado que, a diferencia del UTR de 5′, existe una correlación exponencial entre la longitud del UTR de 3′ y las complejidades celulares y morfológicas de un organismo. Esta correlación sugiere que el UTR de 3′, al igual que las regiones de codificación mRNA, ha sido sometido a una selección natural para permitir una modulación posttranscripcional cada vez más compleja a lo largo de la evolución17. El UTR de 3′ contiene varios sitios de unión para proteínas y miRNAs que afectan a la estabilidad y traducción de la transcripción.
En el presente trabajo, desarrollamos una herramienta para investigar el papel de los dominios altamente conservados en el UTR de 3′ de un GOI para el control de la estabilidad de la transcripción. Nos centramos en el canal epitelial de sodio, subunidad alfa ( ENaC), que desempeña un papel clave en la fisiología epitelial alveolar18. Las células epiteliales alveolares en el cultivo primario se transtrusaron transitoriamente con éxito con los dos componentes del sistema Tet-Off, lo que permite el estudio del papel de la UTR de 3′ en la estabilidad del ARNm con un sistema que afecta mínimamente a la fisiología celular y al metabolismo en comparación con el uso de inhibidores de transcripción con otros protocolos. Se desarrolló una estrategia de clonación para diferenciar la expresión del GOI de la del gen endógeno utilizando un epítopo no endógeno (V5). La respuesta y los plásmidos reguladores se transfirieron a las células epiteliales alveolares mediante una técnica de electroporación de pipetas. Posteriormente, la expresión de la transcripción se midió incubando las células con doxiciclina en diferentes intervalos de tiempo. La vida media de la transcripción fue evaluada por RT-qPCR con un método Cq modificado utilizando el producto mRNA tTA-Ad transinfectado para su normalización. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en diferentes condiciones y definir la participación de las regiones no traducidas con más detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La baja tasa de transfección de las células epiteliales alveolares en el cultivo primario ha sido una grave limitación para el uso del sistema Tet-Off para evaluar la estabilidad del ARNm en estas células. Sin embargo, esta limitación fue superada por la electroporación de pipetas, permitiendo una eficiencia de transfección del 25-30%(Figura 1 y Figura 3)26.
La medición de la estabilidad de la transcrip…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault fue apoyado por una beca proporcionada por la Red de Salud Respiratoria de Quebec y el programa de formación pulmonar de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), una beca de FRSQ y una beca de la Faculté des études Supérieures et Postdoctorados, Universidad de Montreal. Este trabajo fue apoyado por la Cátedra Gosselin-Lamarre en investigación clínica y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
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