Effektivt transskriptionelt plasmidekspressionssystem til undersøgelse af stabiliteten af mRNA-udskrifter i primære alveolære epitelceller
Summary
Her præsenterer vi et værktøj, der kan bruges til at studere den posttransskriptionelle graduering af en udskrift i primære alveolær epitelceller ved hjælp af et uiukbelt ekspressionssystem koblet til en pipetteelektroporationsteknik.
Abstract
At studere posttransskriptionel regulering er afgørende for at forstå gradueringen af en given messenger RNA (mRNA) og dens indvirkning på cellehomøostase og stofskifte. Faktisk kan udsving i udskriftsudtryk ændre oversættelseseffektiviteten og i sidste ende den cellulære aktivitet af en udskrift. Flere eksperimentelle tilgange er blevet udviklet for at undersøge halveringstiden af mRNA selv om nogle af disse metoder har begrænsninger, der forhindrer en korrekt undersøgelse af posttransskriptionel graduering. Et promotorinduktionssystem kan udtrykke et gen af interesse under kontrol af en syntetisk tetracyklinreguleret promotor. Denne metode gør det muligt at foretage halveringstiden for et givet mRNA under enhver eksperimentel tilstand uden at forstyrre cellehomøostase. En væsentlig ulempe ved denne metode er nødvendigheden af at transfect celler, som begrænser brugen af denne teknik i isolerede primære celler, der er meget resistente over for konventionelle transfektionsteknikker. Alveolær epitelceller i primærkulturen er blevet brugt i udstrakt grad til at studere den cellulære og molekylære biologi i alveolær epitel. De unikke egenskaber og fænotype af primære alveolær celler gør det vigtigt at studere de posttransskriptionelle modulationer af gener af interesse i disse celler. Derfor var vores mål at udvikle et nyt værktøj til at undersøge de posttranstransonielle modulationer af mRNAs af interesse i alveolære epitelceller i primærkulturen. Vi designede en hurtig og effektiv forbigående transfection protokol til at indsætte en transskriptionsstyret plasmid udtryk ssystem i primære alveolær epitelceller. Denne kloning strategi, ved hjælp af en viral epitop til at mærke konstruktionen, giver mulighed for let diskrimination af konstruere udtryk fra endogene mRNAs. Ved hjælp af en modificeret ΔΔ-kvantificeringscyklus (Cq) kan udskriftens udtryk kvantificeres med forskellige tidsintervaller for at måle dens halveringstid. Vores data viser effektiviteten af denne nye tilgang til at studere posttransskriptionel regulering i forskellige patofysiologiske tilstande i primære alveolær epitelceller.
Introduction
Flere teknikker er blevet udviklet til at bestemme halveringstiden af mRNAs. Den puls-chase henfald teknik, som udnytter mærket mRNAs, giver mulighed for samtidig evaluering af en stor pulje af mRNAs med minimal cellulære forstyrrelser. Denne fremgangsmåde giver imidlertid ikke mulighed for en direkte vurdering af halveringstiden for en enkelt genudskrift og kan ikke gennemføres for at undersøge den posttransskriptionelle graduering af et mRNA efter stimulation med vækstfaktorer, ROS, alarminer eller inflammation1.
Brugen af transskriptionshæmmere, såsom actinomycin D og α-amanitin, er en forholdsvis enkel metode til måling af mRNA nedbrydningskinetik over tid. En væsentlig fordel ved denne tilgang i forhold til tidligere teknikker(dvs. puls-chase) er afhængig af evnen til direkte at vurdere halveringstiden for en given udskrift og sammenligne, hvordan forskellige behandlinger kan påvirke dens nedbrydning kinetik. Den betydelige skadelige virkning af transskriptionshæmmere på cellefysiologien udgør imidlertid en væsentlig ulempe ved metoden2. Faktisk har hæmningen af hele celletranstranskomet med disse lægemidler den negative bivirkning, der forstyrrer syntesen af nøgleelementer, der er involveret i mRNA-stabilitet, såsom microRNAs (miRNAs), samt ekspressionen og syntesen af RNA-bindende proteiner, som er vigtige for mRNA-nedbrydning og stabilitet. Den alvorlige forstyrrelser af gentransskription af disse stoffer kan derfor kunstrent faktisk ændre nedbrydningskurverne af udskrifter.
Promotorinduktionssystemet repræsenterer en tredje tilgang til måling af halveringstiden for et bestemt mRNA. Denne metode måler nedbrydningen af et bestemt mRNA på samme måde som metoder, der anvender transskriptionshæmmere. Der anvendes hyppigt to typer induktionssystemer: den seruminducerede c-fos promotor3 og Tet-Off-det inducerede system4. Med c-fos-systemet er det ikke nødvendigt at anvende transskriptionshæmmere, der kan være giftige for cellen. Denne metode kræver dog synkronisering af cellecyklus, hvilket forhindrer evaluering af den faktiske stabilitet af en udskrift under mellemfase5. I modsætning hertil giver Tet-Off-systemet mulighed for et stærkt udtryk for det interessegen, der kontrolleres af en syntetisk tetracyklinreguleret promotor. Dette system kræver tilstedeværelsen af to elementer, der skal cotransfected i cellen for at være funktionel. Den første plasmid (pTet-Off) udtrykker det lovgivningsmæssige protein tTA-Adv, en hybrid syntetisk transskriptionsfaktor bestående af prokaryote repressor TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transaktiveringsdomæner fra det virale protein HSV VP16. Den indiske regering klones ind i pTRE-Tight plasmid under kontrol af en syntetisk promotor (PTight),bestående af den minimale sekvens af cytomegalovirus (CMV) promotor smeltet til syv gentagelser af tetO operatør sekvens. Transskriptionen af genet nedstrøms for PTight afhænger af samspillet mellem TetR og tetO. Ved tilstedeværelse af tetracyclin eller dets derivat, doxycyclin, tetr repressor mister sin affinitet for tetO operatør, hvilket fører til et ophør af transskription4. Tet-Off-systemets karakteristika gør det til en ideel model til undersøgelse af specifikke mRNA-udtryk i eukaryote celler, samtidig med at potentielle pleiotropiske virkninger, der er sekundære i forhold til fraværet af prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryote celle6, undgås. Normalt anvendes dobbelt stabile Tet-Off-cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette system til at integrere kopier af regulatoren og responsplasmider for nem adgang til kontrollerbar genekspression7,8,9.
Flere modeller af alveolær epitelceller i kulturen er blevet brugt til at studere den cellulære og molekylære biologi alveolær epitel. I årevis har forskere i udstrakt grad udnyttet menneskelige eller gnavere primære celler10,11 samt udødeliggjortcellelinjer såsom menneskelige A549 eller rotte RLE-6TN celler12,13. Selv om de generelt er mindre spredning og vanskeligere at kultur og transfect, alveolær epitelceller i primærkultur forbliver guld standard for studiet af funktion og dysfunktion af alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk udødeliggjortcellelinjer såsom A549 celler ikke udviser de komplekse egenskaber og fænotyper af primære celler, mens alveolær epitelceller i primærkultur opsummere de vigtigste egenskaber af alveolær epitel, især evnen til at danne en polariseret og stram barriere14,15. Desværre, disse celler er meget resistente over for konventionelle transfektion steknikker, såsom dem, der udnytter liposomer, gør brugen af en promotor-induceret system såsom Tet-Off meget vanskeligt.
Den posttransskriptionelle graduering af mRNAs er en af de mest effektive metoder til hurtigt at modulere genekspressionen af en udskrift16. MRNA 3′ uoversat region (3′ UTR) spiller en vigtig rolle i denne mekanisme. Det er blevet påvist, at der i modsætning til 5′ UTR er en eksponentiel sammenhæng mellem længden af 3′ UTR og en organismes cellulære og morfologiske kompleksitet. Denne sammenhæng tyder på, at 3 ‘UTR, ligesom mRNA kodning regioner, har været udsat for naturlig udvælgelse for at give mulighed for stadig mere komplekse posttransskriptionelle graduering i hele evolution17. De 3 ‘UTR indeholder flere bindende steder for proteiner og miRNAs, der påvirker stabiliteten og oversættelsen af udskriften.
I dette arbejde udviklede vi et værktøj til at undersøge den rolle, som højt bevarede domæner i 3 ‘UTR af en indiske regering til kontrol af udskrift stabilitet. Vi fokuserede på epitelnatriumkanalen, alfaunderenheden (αENaC), som spiller en central rolle i alveolær epitelfysiologi18. Alveolær epitelceller i primærkulturen blev med succes transiently transfected med de to komponenter i Tet-Off-systemet, som giver mulighed for undersøgelse af den rolle, som 3′ UTR i mRNA stabilitet med et system, der minimalt påvirker celle fysiologi og stofskifte i forhold til brugen af transskriptionshæmmere med andre protokoller. Der blev udviklet en kloningsstrategi for at skelne fra den indiske borgers udtryk fra det endogene gen ved hjælp af en ikke-endogent udtrykt epitop (V5). Responsen og regulerende plasmider blev derefter overført til alveolær epitelceller ved hjælp af en pipetteelektroporationsteknik. Efterfølgende blev udskriftenmålt ved at inkubere cellerne med doxycyklin med forskellige tidsintervaller. Udskriftens halveringstid blev evalueret af RT-qPCR med en modificeret Cq-metode ved hjælp af det transfected tTA-Ad mRNA-produkt til normalisering. Gennem vores protokol tilbyder vi en bekvem måde til at studere den posttranstransonelle graduering af en udskrift under forskellige forhold og definere inddragelsen af de uoversatte regioner mere detaljeret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den lave transfektionsrate for alveolær epitelceller i primærkulturen har været en alvorlig begrænsning for brugen af Tet-Off-systemet til at vurdere mRNA-stabiliteten i disse celler. Denne begrænsning blev imidlertid overvundet ved pipetteelektroporation, hvilket gav mulighed for en 25-30% transfektionseffektivitet (figur 1 og figur 3)26.
Målingen af udskriftsstabilitet er afgørende for at forstå gradu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault blev støttet af et stipendium fra Quebec Respiratory Health Network og canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungetræningsprogram, et studenterskab fra FRSQ og et studenterskab fra Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Dette arbejde blev støttet af Gosselin-Lamarre formand i klinisk forskning og den canadiske Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Ricerca sul cancro. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
