יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים
Summary
כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.
Abstract
לימוד הרגולציה הפוסט-טראומטית הוא יסוד להבנת האפנון של שליח מסוים RNA (mRNA) והשפעתה על הומאוסטזיס התאים וחילוף החומרים. ואכן, תנודות הביטוי בתעתיק יכולות לשנות את יעילות התרגום ולבסוף את הפעילות התאית של תעתיק. כמה גישות ניסיוני פותחו כדי לחקור את מחצית החיים של mRNA למרות חלק מהשיטות הללו יש מגבלות המונעות את המחקר הנכון של אפנון הפוסטסקריפט. מערכת השראה היזם יכול לבטא גן של עניין תחת השליטה של מיזם סינתטי מוסדר טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת שערוך מחצית חיים של mRNA נתון תחת כל מצב ניסיוני ללא מטריד הומאוסטזיס התא. חיסרון משמעותי אחד של שיטה זו הוא הצורך בתאי העברה, אשר מגביל את השימוש בטכניקה זו בתאים ראשוניים מבודדים העמידים מאוד בפני טכניקות העברה קונבנציונליות. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית שימשו בהרחבה כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. המאפיינים הייחודיים והפנוטיפים של תאי הכתשיים הראשוניים הופכים אותו לחיוני לחקר מודולרופהפוסט של גנים המעניינים בתאים אלה. לכן, המטרה שלנו הייתה לפתח כלי הרומן כדי לחקור את מודולונות הפוסט של mRNAs של עניין בתאי האפיתל מכתשיים בתרבות הראשית. עיצבנו פרוטוקול מהיר ויעיל של הזיהום החולף כדי להכניס מערכת הבעה מבוקרת בשיטת פלססקריפט לתאי האפיתל הראשוניים. אסטרטגיית שיבוט זו, המשתמשת באפירופה ויראלית כדי לתייג את המבנה, מאפשרת את האפליה הקלה של בניית הביטוי מתוך זה של mRNAs האנדוגניים. באמצעות מחזור ΔΔ שונה (Cq) שיטה, ביטוי התמליל יכול להיות כימות במרווחי זמן שונים כדי למדוד את מחצית החיים שלו. הנתונים שלנו להפגין את היעילות של הגישה הרומן הזה בחקר הרגולציה הפוסט בתנאים שונים פתופסולוגית בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.
Introduction
מספר טכניקות פותחו כדי לקבוע את מחצית החיים של mRNAs. טכניקת ריקבון הדופק מרדף, אשר משתמשת mRNAs, מאפשר הערכה סימולטני של בריכה גדולה של mRNAs עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת הערכה ישירה של מחצית החיים של תעתיק גן יחיד ולא ניתן ליישם כדי ללמוד את אפנון הפוסטסקריפט של מערכת הגירוי הבאה של mRNA עם גורמי גדילה, ROS, מדאיג, או דלקת1.
השימוש במעכבי תעתיק, כגון אקטינומיצין D ו-α-אמטין, היא שיטה פשוטה יחסית למדידת קינטיקה של השפלה mRNA לאורך זמן. אחד היתרונות העיקריים של גישה זו על זה של טכניקות קודמות, (כלומר, דופק-מרדף) מסתמך על היכולת להעריך במישרין את מחצית החיים של תעתיק נתון ולהשוות איך טיפולים שונים יכול להשפיע על הקינטיקה השפלה שלה. עם זאת, ההשפעה המשמעותית משמעותית של מעכבי התעתיק על הפיזיולוגיה של התא מייצגת חיסרון משמעותי של הגישה2. אכן, עיכוב של התא כולו ההמרה עם תרופות אלה יש תופעת לוואי שלילית של perturbing את הסינתזה של אלמנטים מרכזיים המעורבים ביציבות mRNA, כגון microRNAs (miRNAs), כמו גם את הביטוי וסינתזה של חלבונים כריכת RNA, אשר חשובים עבור השפלה ויציבות mRNA. ההפרעות החמורות של תמלול הגנים על-ידי תרופות אלו עלולות לשנות את עקומות ההשפלה של התעתיקים.
מערכת אינדוקציה היזם מייצג גישה שלישית כדי למדוד את מחצית החיים של mRNA ספציפי. שיטה זו מודדת את ההשפלה של mRNA ספציפי באופן דומה לשיטות המשתמשות במעכבי תעתיק. שני סוגים של מערכות אינדוקציה משמשים לעתים קרובות: סרום המושרה c-fos אמרגן3 ואת מערכת inducible Off4. עם מערכת c-fos, השימוש מעכבי שעתוק כי יכול להיות רעיל לתא אין צורך. עם זאת, שיטה זו מחייבת סנכרון של מחזור התא, המונע את הערכת היציבות בפועל של תעתיק במהלך השלב הפנימי5. לעומת זאת, מערכת ט-Off מאפשרת ביטוי חזק של גן העניין (הארה) תחת השליטה של מקדם מוסדר טטרציקלין מוסדרים. מערכת זו מחייבת נוכחות של שני רכיבים שחייבים להיות מזוהמים בתא כדי להיות פונקציונלי. באמצע הפלסטיק הראשון (pTet-Off) מבטא את החלבון הרגולטורי tTA-עו”ד, מקדם שעתוק סינתטי היברידית מורכב של prokaryotic מדיכוי TetR (מ Es, האננכיה coli) התמזגו שלושה תחומים ההפעלה הפעלה של חלבון ויראלי HSV VP16. הגוי משוכפל לתוך pTRE-צר באמצע תחת שליטה של מיזם סינתטי (Pהדוק), הכולל את הרצף המינימלי של cytomegalovirus (cmv) יזם התמזגו שבעה חוזר של רצף המפעיל teto. תמלול של הגן במורד של Pהדוק תלוי באינטראקציה של tetr עם tetr. בנוכחותו של טטרציקלין או הנגזרת שלה, דוקסיציקלין, מאבדת מחדש את הזיקה שלה למפעיל Tetr, המוביל להפסקת שעתוק4. המאפיינים של מערכת ט-Off להפוך אותו למודל אידיאלי למחקר של ביטוי mrna ספציפי בתאי איקריוטית תוך הימנעות השפעות pleiotropic פוטנציאלי משני העדר רצפים prokaryotic הרגולציה בתא איקריוטית6. בדרך כלל, שורות התאים היציבים כפליים (hek 293, הלה וPC12) משמשות עם מערכת זו כדי לשלב עותקים של הרגולטור והתגובה של פלמידים עבור גישה נוחה לביטוי גנטי בשליטה7,8,9.
מספר דגמים של תאים אפיתל מכתשיים בתרבות שימשו כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. במשך שנים, החוקרים מנוצל באופן נרחב בתאים אנושיים או מכרסמים הראשי10,11 , כמו גם קווים מונצח תאים כגון A549 אנושי או עכברוש rle-6tn תאים12,13. למרות שהם בדרך כלל פחות מתרבים וקשה יותר לתרבות לבין transfect, מכתשיים תאי האפיתל בתרבות הראשית להישאר בתקן הזהב למחקר של תפקוד ותפקוד של האפיתל מכתשי בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. אכן, שורות תא מונדמות כגון תאים A549 לא מציגים את המאפיינים המורכבים ופנוטיפים של תאים ראשוניים, ואילו מכתשיים תאי אפיתל בתרבות העיקרית לאחר מכן את המאפיינים העיקריים של האפיתל מכתשי, במיוחד את היכולת ליצור מחסום מקוטב והדוק14,15. למרבה הצער, תאים אלה עמידים מאוד טכניקות החצייה המקובלת, כגון אלה ניצול ליפוזומים, מה שהופך את השימוש של היזם המושרה מערכת כגון ט-Off מאוד קשה.
אפנון הפוסטסקריפט של mRNAs היא אחת השיטות האפקטיביות ביותר למודוללי במהירות את ביטוי הגנים של תעתיק16. אזור ה-mRNA 3 ‘ בלתי מתורגם ‘ (3 ‘ UTR) ממלא תפקיד חשוב במנגנון זה. זה הוכח כי, בניגוד ל 5 ‘ UTR, יש קורלציה אקספוננציאלית בין אורך של 3 ‘ UTR ואת המורכבות הסלולר ו מורפולוגית של אורגניזם. מתאם זה מרמז כי 3 ‘ UTR, כמו אזורי קידוד mRNA, כבר נתון בחירה טבעית כדי לאפשר אפנון מורכב יותר ויותר של הפוסטסקריפט במהלך האבולוציה17. 3 ‘ UTR מכיל מספר אתרים מחייבים עבור חלבונים ו miRNAs המשפיעים על היציבות והתרגום של התעתיק.
בעבודה הנוכחית, פיתחנו כלי כדי לחקור את התפקיד של תחומים שמרו במידה רבה ב-3 ‘ UTR של הגוי על שליטה של התעתיק. התמקדנו בערוץ נתרן האפיתל, יחידת יחידת (αENaC), אשר ממלאת תפקיד מפתח בבית מכתשי הפיזיולוגיה האפיתל18. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית היו בהצלחה משני הצדדים עם שני המרכיבים של מערכת ט-Off, אשר מאפשר ללמוד את התפקיד של 3 ‘ UTR ביציבות mRNA עם מערכת כי המינימלי משפיע הפיזיולוגיה של התא ואת חילוף החומרים בהשוואה לשימוש של מעכבי שעתוק עם פרוטוקולים אחרים. אסטרטגיית שיבוט פותחה כדי להבדיל את הביטוי של הגוי מתוך הגן האנדוסוגגני באמצעות אפירופה בלתי מפותח (V5). התגובה והפלמידים של התקנות הועברו לאחר מכן לתוך מכתשיים תאי האפיתל באמצעות טכניקת פיפורציה חשמלית. לאחר מכן, הביטוי של התעתיק נמדד על-ידי דגירה של התאים עם דוקסיציקלין במרווחי זמן שונים. מחצית החיים של התמליל הוערך על-ידי RT-qPCR עם שיטת Cq ששונתה באמצעות מוצר העברה של טה-אד mRNA לנורמליזציה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה ללימוד האפנון הפוסט-ממדי של תעתיק בתנאים שונים והגדרת המעורבות של האזורים הבלתי מתורגמים ביתר פירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיעור הגידול הנמוך של מכתשי תאים אפיתל בתרבות העיקרית כבר מגבלה רצינית לשימוש מערכת ט-Off כדי להעריך את יציבות mRNA בתאים אלה. עם זאת, מגבלה זו היתה להתגבר על ידי הפיפטה אלקטרופורציה, המאפשר 25-30% יעילות הזיהום (איור 1 ואיור 3)26.
המדידה ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרנסיס מיגס נתמך על ידי מלגת שסופקו על-ידי רשת בריאות הנשימה של קוויבק והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), תוכנית הכשרה לריאות של המכון הימי, מסעדת FRSQ ו-“משלוח של המוני המוני”. . הפוסטדואלס, אוניברסיטת מונטריאול עבודה זו נתמכת על ידי כיסא הגוסליס-למררה במחקר קליני והמוסדות הקנדים לחקר הבריאות [במגב-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Ricerca sul cancro. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
