प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता की जांच के लिए कुशल ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली
Summary
यहां, हम एक उपकरण प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्ट के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो एक प्रेरक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एक पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन तकनीक के साथ मिलकर किया जा सकता है।
Abstract
पोस्टट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन का अध्ययन किसी दिए गए मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के मॉड्यूलेशन और सेल होमोस्टोसिस और मेटाबोलिज्म पर इसके प्रभाव को समझने के लिए मौलिक है। दरअसल, ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति में उतार-चढ़ाव अनुवाद दक्षता और अंततः ट्रांसक्रिप्ट की सेलुलर गतिविधि को संशोधित कर सकता है। एमआरएनए के आधे जीवन की जांच करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, हालांकि इनमें से कुछ विधियों की सीमाएं हैं जो पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन के उचित अध्ययन को रोकती हैं। एक प्रमोटर इंडक्शन सिस्टम सिंथेटिक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में ब्याज के जीन को व्यक्त कर सकता है। यह विधि सेल होमोस्टोसिस को परेशान किए बिना किसी भी प्रायोगिक स्थिति के तहत दिए गए एमआरएनए के आधे जीवन के अनुमान की अनुमति देती है। इस विधि की एक प्रमुख खामी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आवश्यकता है, जो अलग प्राथमिक कोशिकाओं में इस तकनीक के उपयोग को सीमित करती है जो पारंपरिक ट्रांसफेक्शन तकनीकों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं। प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं का बड़े पैमाने पर उपयोग अल्वेलर एपिथेलियम के सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्राथमिक अल्वेलर कोशिकाओं की अनूठी विशेषताएं और फेनोटाइप इन कोशिकाओं में रुचि के जीन के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करना आवश्यक बनाते हैं। इसलिए, हमारा उद्देश्य प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में रुचि के mRNA के पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन की जांच करने के लिए एक उपन्यास उपकरण विकसित करना था। हमने प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रतिलेखन रूप से नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली डालने के लिए एक तेज और कुशल क्षणिक क्षणिक प्रोटोकॉल तैयार किया। निर्माण को टैग करने के लिए एक वायरल एपिटोप का उपयोग करके यह क्लोनिंग रणनीति, एंडोजेनस mRNAs से अभिव्यक्ति का निर्माण करने के आसान भेदभाव के लिए अनुमति देती है। एक संशोधित क्वांटिफिकेशन चक्र (सीक्यू) विधि का उपयोग करके, ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति को अपने आधे जीवन को मापने के लिए विभिन्न समय अंतराल पर निर्धारित किया जा सकता है। हमारे डेटा प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में विभिन्न रोगविज्ञानी स्थितियों में पोस्टट्रांसक्रिप्शनियल विनियमन का अध्ययन करने में इस उपन्यास दृष्टिकोण की दक्षता प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
mRNAs के आधे जीवन का निर्धारण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। पल्स-चेस क्षय तकनीक, जो लेबल वाले mRNAs का उपयोग करती है, न्यूनतम सेलुलर अशांति के साथ mRNAs के एक बड़े पूल के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है। हालांकि, यह दृष्टिकोण एक जीन ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन के प्रत्यक्ष अनुमान की अनुमति नहीं देता है और विकास कारकों, आरओएस, अलार्मिन या सूजन1के साथ उत्तेजना के बाद एमआरएनए के पोस्टट्रांसक्रिप्शन मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता है।
ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों का उपयोग, जैसे कि ऐक्टिनोमाइसिन डी और α-amanitin, समय के साथ एमआरएनए क्षरण काइनेटिक्स को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीका है। पिछली तकनीकों पर इस दृष्टिकोण का एक मुख्य लाभ, (यानी, पल्स-चेस) सीधे किसी दिए गए ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन का अनुमान लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है और तुलना करता है कि विभिन्न उपचार इसके क्षरण गतिज को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, सेल फिजियोलॉजी पर प्रतिलेखन अवरोधकों का महत्वपूर्ण हानिकारक प्रभाव दृष्टिकोण2की एक बड़ी खामी का प्रतिनिधित्व करता है। दरअसल, इन दवाओं के साथ पूरे सेल ट्रांसक्रिप्टोम के अवरोध में एमआरएनए स्थिरता में शामिल प्रमुख तत्वों के संश्लेषण को क्षत-भंग करने का नकारात्मक दुष्प्रभाव होता है, जैसे माइक्रोआरएनए (miRNAs), साथ ही आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति और संश्लेषण, जो एमआरएनए क्षरण और स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए इन दवाओं द्वारा जीन प्रतिलेखन का गंभीर क्षोभ टेप के क्षरण घटता को कलाकृतियों से संशोधित कर सकता है ।
प्रमोटर इंडक्शन सिस्टम एक विशिष्ट एमआरएनए के आधे जीवन को मापने के लिए एक तीसरे दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। यह विधि एक विशिष्ट एमआरएनए के क्षरण को इसी तरह से उन तरीकों के रूप में मापता है जो प्रतिलेखन अवरोधकों का उपयोग करते हैं। दो प्रकार के इंडक्शन सिस्टम का अक्सर उपयोग किया जाता है: सीरम-प्रेरित सी-फॉस प्रमोटर3 और टीईटी-ऑफ इंड्यूसिबल सिस्टम4। सी-फॉस सिस्टम के साथ, ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है जो कोशिका के लिए विषाक्त हो सकते हैं। हालांकि, इस विधि के लिए सेल चक्र सिंक्रोनाइजेशन की आवश्यकता होती है, जो इंटरफेज5के दौरान ट्रांसक्रिप्ट की वास्तविक स्थिरता के मूल्यांकन को रोकता है। इसके विपरीत, टीईटी-ऑफ प्रणाली सिंथेटिक टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में जीन ऑफ इंटरेस्ट (भारत सरकार) की मजबूत अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। इस प्रणाली को दो तत्वों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है जिन्हें कार्यात्मक होने के लिए कोशिका में प्रतिकार किया जाना चाहिए। पहला प्लाज्मिड (पीटीईटी-ऑफ) नियामक प्रोटीन टीटीए-एडीवी को व्यक्त करता है, जो प्रोकैरियोटिक दमनक टेटर (एस्चेरिचिया कोलाई से) से बना एक हाइब्रिड सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है, जो वायरल प्रोटीन एचएसवी VP16 से तीन ट्रांसक्रिप्शन ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन में जुड़ा हुआ है। भारत सरकार को एक सिंथेटिक प्रमोटर (पीटाइट)के नियंत्रण में PTRE-तंग प्लाज्मिड में क्लोन किया जाता है, जिसमें साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर के न्यूनतम अनुक्रम शामिल हैं जो टेटओ ऑपरेटर अनुक्रम के सात दोहराता है। पीटाइट के जीन डाउनस्ट्रीम का ट्रांसक्रिप्शन टेटओ के साथ टेटआर की बातचीत पर निर्भर है। टेट्रासाइक्लिन या इसके व्युत्पन्न, डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में, टेटआर दमन टीईटीओ ऑपरेटर के लिए अपनी आत्मीयता खो देता है, जिससे ट्रांसक्रिप्शन4की समाप्ति होती है। टीईटी-ऑफ प्रणाली की विशेषताएं इसे यूकेरियोटिक कोशिकाओं में विशिष्ट एमआरएनए अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल बनाती हैं, जबकि संभावित प्लियोट्रोपिक प्रभावों से बचती हैं जो यूकेरियोटिक सेल6में प्रोकैरियोटिक नियामक दृश्यों के अभाव के लिए माध्यमिक हैं। आमतौर पर, नियंत्रणीय जीन अभिव्यक्ति7,8,9तक सुविधाजनक पहुंच के लिए नियामक और प्रतिक्रिया प्लाज्मिड की प्रतियों को एकीकृत करने के लिए इस प्रणाली के साथ दोगुना स्थिर टीईटी-ऑफ सेल लाइनों (एचईके 293, वाघेला और पीसी12) का उपयोग किया जाता है।
संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के कई मॉडलों का उपयोग अल्वेलर एपिथेलियम के सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। वर्षों से, शोधकर्ताओं ने मानव या कृंतक प्राथमिक कोशिकाओं10,11 के साथ-साथ मानव A549 या चूहा RLE-6TN कोशिकाओं12,13के रूप में अमर सेल लाइनों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया है । यद्यपि वे आम तौर पर कम प्रोलिफेरेटिव और संस्कृति के लिए अधिक कठिन होते हैं और ट्रांसफेट करने के लिए, प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाएं शारीरिक और रोग की स्थितियों में अल्वेलर एपिथेलियम के कार्य और शिथिलता के अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई हैं। दरअसल, अमर सेल लाइनें जैसे A549 कोशिकाएं प्राथमिक कोशिकाओं की जटिल विशेषताओं और फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं करती हैं, जबकि प्राथमिक संस्कृति में एल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाएं अल्वेलर एपिथेलियम के मुख्य गुणों को फिर से तैयार करती हैं, विशेष रूप से ध्रुवीकृत और तंग बाधा14,15बनाने की क्षमता। दुर्भाग्य से, ये कोशिकाएं पारंपरिक ट्रांसफेक्शन तकनीकों के लिए बहुत प्रतिरोधी हैं, जैसे कि लिपोसोम का उपयोग करने वाले, टीईटी-ऑफ जैसे प्रमोटर-प्रेरित प्रणाली का उपयोग बहुत मुश्किल बना रहे हैं।
16की जीन अभिव्यक्ति को तेजी से कम करने के लिए mRNA का पोस्टट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है । एमआरएनए 3 का अअनुवादित क्षेत्र (3′ यूटीआर) इस तंत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह दिखाया गया है कि, 5 ‘ यूटीआर के विपरीत, 3 ‘ यूटीआर की लंबाई और किसी जीव की सेलुलर और रूपात्मक जटिलताओं के बीच एक घातीय संबंध है । इस सहसंबंध से पता चलता है कि एमआरएनए कोडिंग क्षेत्रों की तरह 3 ‘ यूटीआर, प्राकृतिक चयन के अधीन किया गया है ताकि पूरे विकास17में तेजी से जटिल पोस्टट्रांसक्रिप्शनी मॉड्यूलेशन की अनुमति दी जा सके। 3′ यूटीआर में प्रोटीन और एमआईएनआरए के लिए कई बाध्यकारी साइटें शामिल हैं जो ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता और अनुवाद को प्रभावित करती हैं।
वर्तमान कार्य में, हमने ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता के नियंत्रण के लिए भारत सरकार के 3 ‘यूटीआर में अत्यधिक संरक्षित डोमेन की भूमिका की जांच करने के लिए एक उपकरण विकसित किया। हमने एपिथेलियल सोडियम चैनल, अल्फा सबयूनिट (αENaC) पर ध्यान केंद्रित किया, जो अल्वेलर एपिथेलियल फिजियोलॉजी18में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं को टीईटी-ऑफ प्रणाली के दो घटकों से सफलतापूर्वक क्षणिक रूप से ट्रांसिफिक रूप से ट्रांसिफेशन सिस्टम के दो घटकों से संक्रमित किया गया था, जो एक ऐसी प्रणाली के साथ एमआरएनए स्थिरता में 3 ‘ यूटीआर की भूमिका के अध्ययन के लिए अनुमति देता है जो अन्य प्रोटोकॉल के साथ ट्रांसक्रिप्शन अवरोधकों के उपयोग की तुलना में सेल फिजियोलॉजी और चयापचय को कम से प्रभावित करता है। एक गैर-व्यक्त किए गए एपिटोप (V5) का उपयोग करके भारत सरकार की अभिव्यक्ति को एंडोजेनस जीन से अलग करने के लिए एक क्लोनिंग रणनीति विकसित की गई थी। प्रतिक्रिया और नियामक प्लाज्मिड को फिर पिपेट इलेक्ट्रोपोराशन तकनीक का उपयोग करके अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया गया था। बाद में, ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति को विभिन्न समय अंतराल पर डॉक्सीसाइक्लिन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके मापा गया था। ट्रांसक्रिप्ट के आधे जीवन का मूल्यांकन आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सामान्यीकरण के लिए ट्रांससंक्रमित टीटीए-एड एमआरएनए उत्पाद का उपयोग करके संशोधित सीक्यू विधि के साथ किया गया था। हमारे प्रोटोकॉल के माध्यम से, हम विभिन्न परिस्थितियों में एक ट्रांसक्रिप्ट के पोस्टट्रांसक्रिप्शनमॉड्यूलेशन का अध्ययन करने और अअनुवादित क्षेत्रों की भागीदारी को अधिक विस्तार से परिभाषित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक संस्कृति में अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं की कम ट्रांसफेक्शन दर इन कोशिकाओं में एमआरएनए स्थिरता का आकलन करने के लिए टीईटी-ऑफ प्रणाली के उपयोग के लिए एक गंभीर सीमा रही है। हालांकि, इस सीमा को पि…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
फ्रांसिस Migneault क्यूबेक श्वसन स्वास्थ्य नेटवर्क और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR) फेफड़ों के प्रशिक्षण कार्यक्रम, FRSQ से एक छात्र और Faculté des Études Supérieures एट से एक छात्र त्व द्वारा प्रदान की एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था पोस्टडॉक्टोरल्स, यूनीवर्सिट डी मॉन्ट्रियल। इस काम को नैदानिक अनुसंधान में गॉसेलिन-लामरे चेयर और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान [YBMOP-79544] द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
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