Her presenterer vi et verktøy som kan brukes til å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon i primære alveolære epitelceller ved hjelp av et utilbørlig uttrykkssystem koblet til en pipetteelektroporasjonsteknikk.
Å studere posttranskripsjonsregulering er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gitt budbringer RNA (mRNA) og dens innvirkning på cellehomeostase og metabolisme. Faktisk kan svingninger i transkripsjonsuttrykk endre oversettelseseffektiviteten og til slutt den cellulære aktiviteten til en transkripsjon. Flere eksperimentelle tilnærminger er utviklet for å undersøke halveringstiden til mRNA, selv om noen av disse metodene har begrensninger som forhindrer riktig studie av posttranskripsjonsmodulasjon. Et promotorinduksjonssystem kan uttrykke et gen av interesse under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert promotor. Denne metoden tillater halveringstidestimering av en gitt mRNA under enhver eksperimentell tilstand uten forstyrrende celle homeostase. En stor ulempe med denne metoden er nødvendigheten av transfect celler, som begrenser bruken av denne teknikken i isolerte primære celler som er svært motstandsdyktigmot konvensjonelle transfection teknikker. Alveolære epitelceller i primærkulturen har blitt brukt mye for å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. De unike egenskapene og fenotypen til primære alveolære celler gjør det viktig å studere posttranskripsjonsmodulasjonene av gener av interesse i disse cellene. Derfor var vårt mål å utvikle et nytt verktøy for å undersøke posttranskripsjonsmodulasjonene til mRNAs av interesse for alveoriske epitelceller i primærkulturen. Vi designet en rask og effektiv forbigående transfection protokoll for å sette inn et transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem i primære alveolære epitelceller. Denne kloningstrategi, ved hjelp av en viral epitope for å tagge konstruksjonen, gjør det mulig for enkel diskriminering av konstruere uttrykk fra endogene mRNAs. Ved hjelp av en modifisert ΔΔ quantification syklus (Cq) metode, kan uttrykket av transkripsjonen deretter kvantifiseres med forskjellige tidsintervaller for å måle halveringstiden. Våre data viser effektiviteten av denne nye tilnærmingen i å studere posttranskripsjonsregulering i ulike patofysiologiske forhold i primære alveolære epitelceller.
Flere teknikker er utviklet for å bestemme halveringstiden til mRNAs. Pulsjagende forfallsteknikk, som benytter merkede mRNAer, gjør det mulig å samtidig evaluering av et stort basseng av mRNAer med minimal cellulær forstyrrelse. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke en direkte estimering av halveringstiden til en enkelt gentranskripsjon og kan ikke implementeres for å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en mRNA etter stimulering med vekstfaktorer, ROS, alarmer eller betennelse1.
Bruk av transkripsjonshemmere, som actinomycin D og α-amanitin, er en relativt enkel metode for måling av mRNA nedbrytningskinetikk over tid. En stor fordel med denne tilnærmingen over tidligere teknikker, (dvs. pulsjakt) er avhengig av evnen til å direkte estimere halveringstiden til en gitt transkripsjon og sammenligne hvordan ulike behandlinger kan påvirke nedbrytningskinetikken. Den betydelige skadelige virkningen av transkripsjonshemmere på cellefysiologi representerer imidlertid en stor ulempe for tilnærmingen2. Faktisk har hemmingen av hele celletranskripsjonen med disse stoffene den negative bivirkningen av å perturbing syntesen av viktige elementer involvert i mRNA stabilitet, som microRNAs (miRNAs), samt uttrykk og syntese av RNA-bindende proteiner, som er viktige for mRNA nedbrytning og stabilitet. Den alvorlige perturbasjonen av gentranskripsjon av disse legemidlene kan derfor artefactually endre nedbrytningskurvene av transkripsjoner.
Arrangørens induksjonssystem representerer en tredje tilnærming for å måle halveringstiden til en bestemt mRNA. Denne metoden måler nedbrytningen av en bestemt mRNA på samme måte som metoder som bruker transkripsjonshemmere. To typer induksjonssystemer brukes ofte: serumindusert c-fos-promotor3 og Tet-Off induserbart system4. Med c-fos-systemet er bruk av transkripsjonshemmere som kan være giftige for cellen ikke nødvendig. Denne metoden krever imidlertid synkronisering av cellesyklus, som forhindrer evaluering av den faktiske stabiliteten til en transkripsjon under interfase5. I motsetning tillater Tet-Off-systemet det sterke uttrykket av genet av interesse (GOI) under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert arrangør. Dette systemet krever tilstedeværelse av to elementer som må være cotransfected inn i cellen for å være funksjonell. Den første plasmid (pTet-Off) uttrykker det regulatoriske proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkripsjonsfaktor som består av den prokaryotiske undertrykkeren TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transkripsjonstransaktiveringsdomener fra det virale proteinet HSV VP16. GOI er klonet inn i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (PTight),bestående av den minimale sekvensen av cytomegalovirus (CMV) arrangør smeltet til syv gjentakelser av tetO operatør sekvens. Transkripsjonen av genet nedstrøms av PTight er avhengig av samspillet mellom TetR med tetO. I nærvær av tetracyklin eller dets derivat, doxycyklin, mister TetR-undertrykkeren sin affinitet for tetO-operatøren, noe som fører til en opphør av transkripsjon4. Egenskapene til Tet-Off-systemet gjør det til en ideell modell for studiet av spesifikke mRNA-uttrykk i eukaryyotiske celler samtidig som det unngår potensielle pleiotropiske effekter som er sekundære til fraværet av prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryotisk celle6. Vanligvis brukes dobbelt stabile Tet-Off cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette systemet til å integrere kopier av regulatoren og responsplasmider for praktisk tilgang til kontrollerbart genuttrykk7,8,9.
Flere modeller av alveolære epitelceller i kulturen har blitt brukt til å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. I årevis har forskere i stor grad utnyttet menneskelige eller gnagerprimære celler10,11 samt udødelige cellelinjer som menneskelig A549 eller rotte RLE-6TN celler12,13. Selv om de generelt er mindre proliferative og vanskeligere å kultur og transfect, alveolære epitelceller i primærkulturen forblir gullstandarden for studiet av funksjonen og dysfunksjonen av alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk viser udødeliggjortcellelinjer som A549-celler ikke de komplekse egenskapene og fenotypene til primærceller, mens alveorene epitelceller i primærkultur rekapitulerer hovedegenskapene til alveolærepitelet, spesielt evnen til å danne en polarisert og stram barriere14,15. Dessverre er disse cellene svært motstandsdyktige mot konvensjonelle transfection teknikker, for eksempel de som bruker liposomer, noe som gjør bruk av et promotor-indusert system som Tet-Off svært vanskelig.
Den posttranskripsjonelle moduleringen av mRNAs er en av de mest effektive metodene for raskt å modulere genuttrykket til en transkripsjon16. MRNA 3′ uoversatte region (3′ UTR) spiller en viktig rolle i denne mekanismen. Det har vist seg at det, i motsetning til 5′ UTR, er en eksponentiell sammenheng mellom lengden på 3′ UTR og de cellulære og morfologiske kompleksitetene til en organisme. Denne korrelasjonen antyder at 3′ UTR, som mRNA-kodeområdene, har blitt utsatt for naturlig utvalg for å tillate stadig mer kompleks posttranskripsjonsmodulasjon gjennom evolusjon17. 3′ UTR inneholder flere bindende steder for proteiner og miRNAer som påvirker stabiliteten og oversettelsen av transkripsjonen.
I det nåværende arbeidet utviklet vi et verktøy for å undersøke rollen som svært bevarte domener i 3′ UTR av en GOI for kontroll av transkripsjonsstabilitet. Vi fokuserte på epitelnatriumkanalen, alfa-underenheten (αENaC), som spiller en nøkkelrolle i alveolær epitelfysiologi18. Alveolære epitelceller i primærkulturen ble vellykket transiently transfected med de to komponentene i Tet-Off-systemet, noe som gjør det mulig for studiet av rollen til 3 ‘ UTR i mRNA stabilitet med et system som minimalt påvirker cellefysiologi og metabolisme i forhold til bruk av transkripsjonshemmere med andre protokoller. En kloningstrategi ble utviklet for å skille uttrykket av GOI fra det endogene genet ved hjelp av en nonendogenously uttrykt epitop (V5). Responsen og regulatoriske plasmider ble deretter overført til alveolære epitelceller ved hjelp av en pipetteelektroporasjonsteknikk. Deretter ble uttrykket av transkripsjonen målt ved å inkubere cellene med doxycyklin med forskjellige tidsintervaller. Halveringstiden av transkripsjonen ble evaluert av RT-qPCR med en modifisert Cq-metode ved hjelp av det transinfiserte tTA-Ad mRNA-produktet for normalisering. Gjennom vår protokoll tilbyr vi en praktisk måte å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon under forskjellige forhold og definere involveringav de uoversatte regionene mer detaljert.
Den lave transfection rate av alveolære epitelceller i primærkulturen har vært en alvorlig begrensning for bruk av Tet-Off-systemet for å vurdere mRNA stabilitet i disse cellene. Denne begrensningen ble imidlertid overvunnet av pipetteelektroporasjon, slik at en 25-30% transfection effektivitet (Figur 1 og figur 3)26.
Målingen av transkripsjonstabilitet er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gi…
The authors have nothing to disclose.
Francis Migneault ble støttet av et fellesskap levert av Quebec Respiratory Health Network og Canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungetreningsprogram, et studentskap fra FRSQ og et studentskap fra Faculté des Études Supérieures et Postdoktor, Université de Montréal. Dette arbeidet ble støttet av Gosselin-Lamarre Chair i klinisk forskning og Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
NheI | New England Biolabs | R0131S | |
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |