Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias
Summary
Aqui, apresentamos uma ferramenta que pode ser usada para estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão indutível acoplado a uma técnica de eletroporação de pipeta.
Abstract
Estudar a regulação pós-transcricional é fundamental para compreender a modulação de um determinado RNA mensageiro (mRNA) e seu impacto na homeostase celular e no metabolismo. De fato, flutuações na expressão da transcrição poderiam modificar a eficiência de tradução e, finalmente, a atividade celular de uma transcrição. Várias abordagens experimentais foram desenvolvidas para investigar a meia-vida do mRNA, embora alguns desses métodos tenham limitações que impedem o estudo adequado da modulação pós-transcricional. Um sistema de indução de promotores pode expressar um gene de interesse o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite a estimativa de meia-vida de um determinado mRNA qualquer condição experimental sem perturbar a homeostase celular. Uma grande desvantagem desse método é a necessidade de transfect as células, o que limita o uso dessa técnica em células primárias isoladas que são altamente resistentes às técnicas convencionais de transfecção. Células epiteliais alveolares na cultura primária têm sido usadas extensivamente para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. As características únicas e o fenótipo das células alveolares primárias tornam essencial estudar as modulações pós-transcricionais de genes de interesse nessas células. Portanto, nosso objetivo era desenvolver uma nova ferramenta para investigar as modulações pós-transcricionais de mRNAs de interesse em células epiteliais aerarelaras na cultura primária. Projetamos um protocolo de transfecção transitória rápido e eficiente para inserir um sistema de expressão plasmídea controlada transcricionalmente em células epiteliais alveolarprimárias primárias. Essa estratégia de clonagem, utilizando um epítopo viral para marcar o construto, permite a fácil discriminação da expressão construtiva a partir da de mRNAs endógenas. Usando um método modificado de ciclo de quantificação ΔΔ (Cq), a expressão da transcrição pode então ser quantificada em diferentes intervalos de tempo para medir sua meia-vida. Nossos dados demonstram a eficiência dessa nova abordagem no estudo da regulação pós-transcricional em várias condições fisiopatológicas em células epiteliais alveolarprimárias primárias.
Introduction
Várias técnicas foram desenvolvidas para determinar a meia-vida dos mRNAs. A técnica de decaibilidade de perseguição de pulso, que utiliza mRNAs rotulados, permite a avaliação simultânea de uma grande piscina de mRNAs com perturbação celular mínima. No entanto, essa abordagem não permite uma estimativa direta da meia-vida de uma única transcrição genética e não pode ser implementada para estudar a modulação pós-transcricional de um mRNA após a estimulação com fatores de crescimento, ROS, alarminas ou inflamação1.
O uso de inibidores de transcrição, como actinomicina D e α-amanitina, é um método relativamente simples para medir a cinética da degradação do mRNA ao longo do tempo. Uma das principais vantagens dessa abordagem em relação à das técnicas anteriores, (ou seja, perseguição de pulso) depende da capacidade de estimar diretamente a meia-vida de uma determinada transcrição e comparar como diferentes tratamentos poderiam afetar sua cinética de degradação. No entanto, o impacto deletério significativo dos inibidores de transcrição na fisiologia celular representa uma grande desvantagem da abordagem2. De fato, a inibição de todo o transcriptome celular com essas drogas tem o efeito colateral negativo de perturbar a síntese de elementos-chave envolvidos na estabilidade do mRNA, como microRNAs (miRNAs), bem como a expressão e síntese de proteínas de ligação de RNA, que são importantes para a degradação e estabilidade do mRNA. A perturbação severa da transcrição genética por essas drogas poderia, portanto, modificar as curvas de degradação das transcrições.
O sistema de indução do promotor representa uma terceira abordagem para medir a meia-vida de um mRNA específico. Este método mede a degradação de um mRNA específico de forma semelhante aos métodos que utilizam inibidores de transcrição. Dois tipos de sistemas de indução são frequentemente utilizados: o promotor c-fos induzido pelo soro3 e o sistema induível Tet-Off4. Com o sistema c-fos, o uso de inibidores de transcrição que podem ser tóxicos para a célula não é necessário. No entanto, este método requer a sincronização do ciclo celular, o que impede a avaliação da estabilidade real de uma transcrição durante a interfase5. Em contraste, o sistema Tet-Off permite a forte expressão do gene de interesse (GOI) o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requer a presença de dois elementos que devem ser cotransfecdos na célula para serem funcionais. O primeiro plasmídeo (pTet-Off) expressa a proteína regulatória tTA-Adv, um fator híbrido de transcrição sintética composto pelo repressor procariótico TetR (de Escherichia coli) fundido a três domínios de transativação de transcrição da proteína viral HSV VP16. O GOI é clonado no plasmídeo pTRE-Tight o controle de um promotor sintético (PTight),compreendendo a seqüência mínima do promotor citomegalovírus (CMV) fundido a sete repetições da seqüência do operador tetO. A transcrição do gene a jusante de PTight depende da interação de TetR com tetO. Na presença de tetraciclina ou sua derivada, doxiciclina, o repressor TetR perde sua afinidade com o operador de tetO, levando a uma cessação da transcrição4. As características do sistema Tet-Off tornam-no um modelo ideal para o estudo da expressão específica do mRNA em células eucarióticas, evitando potenciais efeitos pleiotrópicos que são secundários à ausência de seqüências regulatórias procadroticas em células eucarióticas6. Normalmente, linhas de células Tet-Off duplamente estáveis (HEK 293, HeLa e PC12) são usadas com este sistema para integrar cópias do regulador e plasmídeos de resposta para acesso conveniente à expressão genética controlável7,8,9.
Vários modelos de células epiteliais aláslaras na cultura têm sido usados para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. Durante anos, os pesquisadores utilizaram extensivamente células primárias humanas ou roedores10,11, bem como linhas celulares imortalizadas, como células Humanas A549 ou RLE-6TN de rato12,13. Embora geralmente sejam menos proliferativas e mais difíceis de cultura e transfect, as células epiteliais aleláscas na cultura primária continuam sendo o padrão-ouro para o estudo da função e disfunção do epitélio alveolar em condições fisiológicas e patológicas. De fato, linhas celulares imortalizadas como as células A549 não exibem as características complexas e fenótipos das células primárias, enquanto as células epiteliais alveolares na cultura primária recapitulam as principais propriedades do epitélio alveolar, em particular a capacidade de formar uma barreira polarizada e apertada14,15. Infelizmente, essas células são muito resistentes às técnicas convencionais de transfecção, como aquelas que utilizam liposóis, tornando muito difícil o uso de um sistema induzido pelo promotor, como o Tet-Off.
A modulação pós-transcricional de mRNAs é um dos métodos mais eficazes para modular rapidamente a expressão genética de uma transcrição16. A região não traduzida do mRNA 3 ‘UTR’ desempenha um papel importante nesse mecanismo. Foi demonstrado que, ao contrário do UTR de 5′, há uma correlação exponencial entre o comprimento do UTR de 3′ e as complexidades celular e morfológica de um organismo. Essa correlação sugere que o UTR de 3”, como as regiões de codificação mRNA, tem sido submetido à seleção natural para permitir uma modulação pós-transcricional cada vez mais complexa ao longo da evolução17. O UTR de 3′ contém vários locais de ligação para proteínas e miRNAs que afetam a estabilidade e a tradução da transcrição.
No presente trabalho, desenvolvemos uma ferramenta para investigar o papel de domínios altamente conservados no UTR de 3′ de um GOI para o controle da estabilidade da transcrição. Focamos no canal epitelial de sódio, subunidade alfa (αENaC), que desempenha um papel fundamental na fisiologia epitelial aveolar18. As células epiteliais alveolares na cultura primária foram transfecentes com sucesso com os dois componentes do sistema Tet-Off, o que permite o estudo do papel do UTR de 3′ na estabilidade do mRNA com um sistema que afeta minimamente a fisiologia celular e o metabolismo em comparação com o uso de inibidores de transcrição com outros protocolos. Uma estratégia de clonagem foi desenvolvida para diferenciar a expressão do GoI da do gene endógeno utilizando um epítopo não totalmente expresso (V5). A resposta e os plasmídeos regulatórios foram então transferidos para células epiteliais aláscas usando uma técnica de eletroporação de pipeta. Posteriormente, a expressão da transcrição foi medida pela incubação das células com doxiciclina em diferentes intervalos de tempo. A meia-vida da transcrição foi avaliada por RT-qPCR com um método Cq modificado utilizando o produto transfeccionado tTA-Ad mRNA para normalização. Através do nosso protocolo, oferecemos uma maneira conveniente de estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em diferentes condições e definir o envolvimento das regiões não traduzidas com mais detalhes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A baixa taxa de transfecção de células epiteliais alveolares na cultura primária tem sido uma séria limitação para o uso do sistema Tet-Off para avaliar a estabilidade do mRNA nessas células. No entanto, essa limitação foi superada pela eletroporação da pipeta, permitindo uma eficiência de transfecção de 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
A medição da estabilidade da transcrição é fundamental pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault foi apoiado por uma bolsa da Rede de Saúde Respiratória de Quebec e do programa de treinamento pulmonar do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), um estudante da FRSQ e um aluno da Faculdade des Études Supérieures et Pós-doutorado, Université de Montréal. Este trabalho foi apoiado pela Cátedra Gosselin-Lamarre em pesquisa clínica e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
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