Effektivt transkriptionsstyrt plasmiduttryckssystem för undersökning av stabiliteten hos mRNA-avskrifter i primära Alveolar Epitelceller
Summary
Här presenterar vi ett verktyg som kan användas för att studera posttranscriptional modulering av en utskrift i primära alveolar epitelceller med hjälp av ett inducerbart uttryck system kopplat till en pipett elektroporation teknik.
Abstract
Att studera posttranscriptional reglering är grundläggande för att förstå moduleringen av en viss budbärare RNA (mRNA) och dess inverkan på cellhomeostas och metabolism. Fluktuationer i avskriftuttryck kan ändra översättningseffektiviteten och i slutändan cellaktiviteten för en utskrift. Flera experimentella metoder har utvecklats för att undersöka halveringstiden för mRNA även om vissa av dessa metoder har begränsningar som förhindrar korrekt studie av posttranscriptional modulering. Ett promotorinduktionssystem kan uttrycka en gen av intresse under kontroll av en syntetisk tetracyklinreglerad promotor. Denna metod gör det möjligt att uppskatta halveringstiden av en given mRNA under något experimentellt tillstånd utan att störa cellhomeostas. En viktig nackdel med denna metod är nödvändigheten av transfect celler, som begränsar användningen av denna teknik i isolerade primära celler som är mycket resistenta mot konventionella transfection tekniker. Alveolar epitelceller i primärkulturen har använts i stor utsträckning för att studera alveolarepitels cell- och molekylärbiologi. De unika egenskaperna och fenotypen av primära alveolarceller gör det viktigt att studera posttranskriptionella modulering av gener av intresse för dessa celler. Därför var vårt mål att utveckla ett nytt verktyg för att undersöka posttranscriptionella moduler ingav mRNAs av intresse för alveolar epitelceller i primärkulturen. Vi utformade ett snabbt och effektivt transienta transfection protokoll för att infoga ett transkriptionsstyrt plasmid uttrycksystem i primära alveolar epitelceller. Denna kloning strategi, med hjälp av en viral epitope att märka konstruktionen, möjliggör enkel diskriminering av konstruera uttryck från endogena mRNAs. Med hjälp av en modifierad ΔΔ kvantifieringscykel (Cq) metod kan uttrycket av avskriften sedan kvantifieras med olika tidsintervall för att mäta dess halveringstid. Våra data visar effektiviteten i denna nya metod för att studera posttranscriptional reglering i olika patofysiologiska förhållanden i primära alveolar epitelceller.
Introduction
Flera tekniker har utvecklats för att bestämma halveringstiden för mRNAs. Pulsjakten spånteknik, som använder märkta mRNAs, möjliggör samtidig utvärdering av en stor pool av mRNAs med minimal cellulära störningar. Detta tillvägagångssätt tillåter dock inte en direkt uppskattning av halveringstiden för en enda genavskrift och kan inte genomföras för att studera posttranscriptional modulering av en mRNA efter stimulering med tillväxtfaktorer, ROS, alarminer eller inflammation1.
Användningen av transkriptionshämmare, såsom aktinomycin D och α-amanitin, är en relativt enkel metod för att mäta mRNA-nedbrytningskinetik över tiden. En stor fördel med detta tillvägagångssätt jämfört med tidigare tekniker, (dvs puls-chase) bygger på förmågan att direkt uppskatta halveringstiden för en viss utskrift och jämföra hur olika behandlingar kan påverka dess nedbrytning kinetik. Emellertid, den betydande skadliga effekten av transkriptionshämmare på cellfysiologi utgör en stor nackdel med metoden2. Faktum är att hämningen av hela celltranskriptomen med dessa läkemedel har den negativa bieffekten av att störa syntesen av viktiga element som är involverade i mRNA-stabilitet, såsom microRNAs (miRNAs), samt uttryck och syntes av RNA-bindande proteiner, som är viktiga för mRNA-nedbrytning och stabilitet. Den allvarliga störningen av gentranskription av dessa läkemedel kan därför artefactually ändra nedbrytningskurvorna av transkriptioner.
Det promotoriska induktionssystemet representerar en tredje metod för att mäta halveringstiden för en specifik mRNA. Denna metod mäter nedbrytningen av en specifik mRNA på ett liknande sätt som metoder som använder transkriptionshämmare. Två typer av induktionssystem används ofta: serum-inducerad c-fos promotorn3 och Tet-Off inducible system4. Med c-fos-systemet behövs inte användning av transkriptionshämmare som kan vara giftiga för cellen. Den här metoden kräver dock synkronisering av cellcykeln, vilket förhindrar utvärdering av den faktiska stabiliteten i en utskrift under interfas5. Tet-Off-systemet gör däremot det starka uttrycket av den intressegen (GOI) som kontrolleras av en syntetisk tetracyklinreglerad promotor. Detta system kräver att förekomsten av två element som måste cotransfected i cellen för att fungera. Den första plasmid (pTet-Off) uttrycker det reglerande proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkriptionsfaktor som består av prokaryota förtryckeren TetR (från Escherichia coli) smält till tre transkriptiontransaktiveringdomäner från viralproteinet HSV VP16. Den goi klonas i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (PTight),bestående av den minimala sekvensen av cytomegalovirus (CMV) promotorn smält till sju upprepningar av tetO operatören sekvens. Transkriptionen av genen nedströms PTight är beroende av interaktionen mellan TetR med tetO. I närvaro av tetracyklin eller dess derivat, doxycyklin, tetr förtryckeren förlorar sin affinitet för tetO operatören, vilket leder till ett upphörande av transkription4. Egenskaperna hos Tet-Off-systemet gör det till en idealisk modell för studier av specifika mRNA uttryck i eukaryota celler samtidigt som man undviker potentiella pleiotropa effekter som är sekundära till frånvaron av prokaryota regleringssekvenser i eukaryota cell6. Vanligtvis, dubbelt stabila Tet-Off cellinjer (HEK 293, HeLa och PC12) används med detta system för att integrera kopior av regulatorn och svar plasmids för bekväm tillgång till kontrollerbara genuttryck7,8,9.
Flera modeller av alveolar epitelceller i kultur har använts för att studera den cellulära och molekylära biologin av alveolar epitel. I åratal har forskare i stor utsträckning använt mänskliga eller gnagare primära celler10,11 samt förevigade cellinjer såsom mänskliga A549 eller råtta RLE-6TN celler12,13. Även om de i allmänhet är mindre proliferativa och svårare att odla och transfect, alveolar epitelceller i primärkultur förblir guldmyntfoten för studier av funktionen och dysfunktion av alveolar epitel i fysiologiska och patologiska tillstånd. I själva verket uppvisar förevigade cellinjer som A549-celler inte de komplexa egenskaperna och fenotyperna av primära celler, medan alveolar epitelceller i primärkulturen rekapitulerade de viktigaste egenskaperna hos alveolarepitelet, särskilt förmågan att bilda en polariserad och stram barriär14,15. Tyvärr, dessa celler är mycket resistenta mot konventionella transfection tekniker, såsom de som använder liposomer, vilket gör användningen av en promotor-inducerad system som Tet-Off mycket svårt.
Posttranscriptional modulering av mRNAs är en av de mest effektiva metoderna för att snabbt modulera genen uttryck av en utskrift16. Den oöversatta regionen mRNA 3 (3′ UTR) spelar en viktig roll i denna mekanism. Det har visat sig att det, till skillnad från 5 ‘ UTR, finns ett exponentiellt samband mellan längden på 3 ‘ UTR och cellulära och morfologiska komplexiteten hos en organism. Denna korrelation tyder på att 3 ‘ UTR, liksom mRNA kodning regioner, har utsatts för naturligt urval för att möjliggöra allt mer komplexa posttranscriptional modulering helaevolutionen 17. 3′ UTR innehåller flera bindningsplatser för proteiner och miRNAs som påverkar stabiliteten och översättningen av avskriften.
I det aktuella arbetet utvecklade vi ett verktyg för att undersöka rollen av mycket bevarade domäner i 3 ‘ UTR av en GOI för kontroll av utskrift stabilitet. Vi fokuserade på epitelial natriumkanal, alfa underavdelning (αENaC), som spelar en nyckelroll i alveolar epitelfysiologi18. Alveolar epitelceller i primärkultur var framgångsrikt övergående transfected med de två komponenterna i Tet-Off-systemet, vilket möjliggör studier av rollen av 3 UTR i mRNA stabilitet med ett system som minimalt påverkar cellfysiologi och metabolism i jämförelse med användningen av transkriptionshämmare med andra protokoll. En kloningsstrategi utvecklades för att skilja uttryck för de kinesiska direktionerna från den endogena genen med hjälp av en nonendogenously uttryckt epitop (V5). Responsen och regulatoriska plasmider överfördes sedan till alveolarepitelceller med hjälp av en pipettelektroporationsteknik. Därefter mättes uttrycket av avskriften genom att inkubera cellerna med doxycyklin med olika tidsintervall. Halveringstiden för avskriften utvärderades av RT-qPCR med en modifierad Cq-metod med hjälp av den transinfekterade tTA-Ad mRNA-produkten för normalisering. Genom vårt protokoll erbjuder vi ett bekvämt sätt att studera posttranscriptional modulering av en utskrift under olika förhållanden och definiera deltagande av oöversatta regioner mer i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den låga transfection graden av alveolar epitelceller i primärkulturen har varit en allvarlig begränsning för användningen av Tet-Off-systemet för att bedöma mRNA stabilitet i dessa celler. Denna begränsning övervanns dock genom pipettelektroporation, vilket möjliggör en transfectioneffektivitet på 25-30 %(figur 1 och figur 3)26.
Mätningen av transkriptionsstabilitet är grundläggande för att fö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault stöddes av ett stipendium från Quebec Respiratory Health Network och Canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungutbildningsprogram, ett studentskap från FRSQ och ett studentskap från Faculté des Études Supérieures et Postdoktorer, Université de Montréal. Detta arbete stöddes av Gosselin-Lamarre ordförande i klinisk forskning och den kanadensiska Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Riferimenti
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Ricerca sul cancro. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
