Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones
Summary
El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.
Abstract
La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y hay opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con enfermedad metastásica. La identificación y prueba de nuevas dianas terapéuticas que faciliten el desarrollo de mejores tratamientos para la enfermedad metastásica requiere modelos preclínicos in vivo. Aquí se muestra un modelo de ratón singérico para decir la colonización metastásica del cáncer de mama y el crecimiento posterior. Las células cancerosas metastásicas se transduelen de forma estable con vectores virales que codifican la luciferasa de las luciérnagas y las proteínas ZsGreen. Los genes candidatos son manipulados de forma estable en células cancerosas que expresan luciferase/ZsGreen y luego las células se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola para analizar la colonización y el crecimiento metastásicos. A continuación, se utiliza un dispositivo de imágenes in vivo para medir la bioluminiscencia o fluorescencia de las células tumorales en los animales vivos para cuantificar los cambios en la carga metastásica con el tiempo. La expresión de la proteína fluorescente permite cuantificar el número y el tamaño de las metástasis en los pulmones al final del experimento sin necesidad de seccionar o tinción histológica. Este enfoque ofrece una manera relativamente rápida y fácil de probar el papel de los genes candidatos en la colonización y el crecimiento metastásicos, y proporciona mucha más información que los ensayos tradicionales de metástasis venosa de cola. Con este enfoque, mostramos que la reducción de la reducción de la carga metastásica en los pulmones y el desenlace simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y del activador transcripcional con un motivo de unión a la PDZ (TAZ) en las células de cáncer de mama reduce la carga metastásica en los pulmones y que esta carga reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente deteriorada y un crecimiento reducido de metástasis.
Introduction
El cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en todo el mundo1 y la metástasis es responsable de la mayoría de estas muertes2,3. Sin embargo, una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que rigen la colonización metastásica y el crecimiento posterior ha obstaculizado el desarrollo de tratamientos eficaces para la enfermedad metastásica. La identificación de nuevas dianas terapéuticas requiere un ensayo para probar cómo la expresión o función perturbada de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. Mientras que los modelos de ratón autóctonos tienen sus ventajas, consumen mucho tiempo y son costosos de generar, lo que los hace más adecuados para la validación de destino en lugar de la detección de objetivos. Los sistemas modelo de trasplante en los que el gen candidato se perturba en las células cancerosas in vitro y luego se evalúan in vivo los efectos sobre el potencial metastásico, son menos costosos y de mayor rendimiento que los modelos autóctonos. Además, los vectores virales para la administración estable de ARNi, CRISPR/CAS9 y transgenes están ampliamente disponibles, por lo que es relativamente fácil perturbar prácticamente cualquier gen o genes de interés en las líneas celulares de una célula cancerosa. Este enfoque también se puede utilizar para analizar el papel de los genes candidatos en la colonización metastásica y el crecimiento en las líneas celulares de cáncer humano trasplantando las células en ratones inmunocomprometidos o humanizados.
Los dos tipos de ensayos utilizados para probar la formación de metástasis por células cancerosas trasplantadas in vivo son ensayos de metástasis espontáneas y ensayos experimentales de metástasis. En los ensayos espontáneos de metástasis4,5, las células cancerosas se inyectan en ratones, se les permite formar un tumor primario, y luego se analiza la formación espontánea de metástasis y el crecimiento posterior. La fuerza de este modelo es que las células deben completar todos los pasos del proceso metastásico para formar tumores metastásicos. Sin embargo, muchas líneas celulares cancerosas no hacen metástasis eficientemente en modelos de metástasis espontánea, y cualquier manipulación de las células que afecta el crecimiento del tumor primario puede confundir los resultados del ensayo de metástasis. Los ensayos experimentales de metástasis, en los que las células cancerosas se inyectan directamente en la circulación, se utilizan para evitar estos escollos. Los ensayos de metástasis experimentales comunes incluyen la inyección de vena de cola6,7,8 (y se demuestra aquí), inyección intracardiaca9,y la inyección de vena porta10.
El propósito del protocolo presentado aquí es proporcionar un ensayo experimental de metástasis in vivo que permita a un investigador monitorear la formación y el crecimiento de metástasis en tiempo real, así como cuantificar el número y el tamaño de la metástasis del punto final en los pulmones del mismo ratón. Para ello, los ensayos tradicionales de metástasis de la cola experimental6,7,8 se combinan con imágenes de animales vivos, utilizando un dispositivo de imagen in vivo9,11,12,13,14. Las células tumorales que expresan establemente tanto la luciferasa como una proteína fluorescente se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola y luego el dispositivo de imágenes in vivo se utiliza para medir los cambios en la carga metastásica en los pulmones a lo largo del tiempo(Figura 1). Sin embargo, el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo no puede distinguir ni medir el tamaño de las metástasis individuales. Por lo tanto, al final del experimento, se utiliza un estereomicroscopio fluorescente para contar el número y medir el tamaño de las metástasis fluorescentes en los pulmones sin necesidad de seccionamiento e histología o inmunohistoquímica(Figura 1). Este protocolo se puede utilizar para probar cómo la alteración de la expresión o función de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. También se pueden probar posibles compuestos terapéuticos como moléculas pequeñas o anticuerpos de bloqueo de funciones.
Para demostrar este enfoque, primero realizamos un experimento de prueba de concepto en el que el factor de replicación esencial, la proteína de replicación A3 (RPA3) se derriba en las células de cáncer de mama de ratón metastásico. Mostramos que los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 tienen una carga metastásica significativamente menor en cada punto de tiempo en comparación con los ratones inyectados con células de control. El análisis de los pulmones que contienen metástasis muestra que esta carga metastásica reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente reducida y un crecimiento deteriorado de las metástasis que se forman. Para demostrar aún más esta técnica, probamos si el derribo simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivador transcripcional con un motivo de unión a pdZ (TAZ) afecta la colonización metastásica o el crecimiento posterior. YAP y TAZ son dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los efectores descendentes críticos de Hippo Pathway. Nosotros15,16 y otros hemos implicado YAP y TAZ en metástasis (revisado en17,18,19), lo que sugiere que estas proteínas son buenas dianas terapéuticas. Consistentemente, encontramos que los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ habían reducido significativamente la carga metastásica. El análisis de los pulmones mostró que las células de derribo YAP/TAZ formaban muchas menos metástasis y que las metástasis que se formaban eran más pequeñas. Estos experimentos demuestran cómo los ensayos experimentales de metástasis permiten a un investigador probar rápida y económicamente el papel de un gen candidato en la formación y el crecimiento de metástasis. Además, muestran cómo el uso combinado de imágenes de animales vivos y la cuantificación fluorescente de metástasis en pulmones enteros permite al investigador comprender mejor los pasos durante la colonización metastásica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos del método
Es fundamental optimizar el número de células inyectadas (paso 3) para una línea celular dada y la tensión del ratón, ya que esto puede influir en gran medida en el número de metástasis que se forman y la longitud del experimento. Si se inyectan demasiadas células o las metástasis crecen durante demasiado tiempo, las metástasis pueden ser difíciles de contar haciendo que los efectos de la manipulación genética sean difíciles de evaluar. Sin embargo, si se inye…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Emily Norton por ayudar con las infecciones virales y la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias a Ryan Kanai por ayudar con la adquisición de imágenes de los pulmones y Kate E. Tubbesing por la ayuda con el análisis de imágenes de las metástasis verdes en los pulmones. Agradecemos al personal de la instalación de investigación animal por su apoyo y por la ayuda en la preparación de este video. Este trabajo fue apoyado por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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