Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína
Summary
Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.
Abstract
Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.
Introduction
Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.
Em contraste, o IP-MS mostra baixa eficiência na captura de PPIs transitórios ou fracos, e também é inadequado para aquelas proteínas com baixa abundância ou alta hidrofobicidade. Muitas proteínas importantes envolvidas nas vias de sinalização vegetal, como quinases semelhantes a receptores (RLKs) ou a família NLR de receptores imunológicos são expressas em níveis baixos e frequentemente interagem com outras proteínas transitoriamente. Por isso, restringe muito a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas.
Recentemente, métodos de rotulagem de proximidade (PL) baseados em ascorbate peroxidase (APEX) e um mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conhecido como BioID) foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de PPIs2,3,4. O princípio da PL é que uma proteína de interesse alvo é fundida com uma enzima, que catalisa a formação de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Estes bio-AMP livres são liberados por enzimas PL e difusos para a proximidade da proteína alvo, permitindo a biotinylação de proteínas proximais nas aminas primárias dentro de um raio estimado de 10 nm5.
Essa abordagem tem vantagens significativas em relação às abordagens tradicionais Y2H e IP-MS, como a capacidade de capturar PPIs transitórios ou fracos. Além disso, o PL permite a rotulagem de proteínas proximais da proteína alvo em seus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL têm desvantagens únicas ao aplicá-las em diferentes sistemas. Por exemplo, embora a APEX ofereça cinética de marcação mais alta em comparação com o BioID e seja aplicada com sucesso em sistemas de mamíferos, a exigência de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) nesta abordagem torna-o inadequado para estudos de PL em plantas.
Em contraste, o PL baseado em BioID evita o uso do Tóxico H2O2, mas a taxa de rotulagem é lenta (exigindo 18-24 h para completar a biotinylação), tornando assim a captura de PPIs transitórios menos eficiente. Além disso, a maior temperatura de incubação (37 °C) necessária para um PL eficiente pelo BioID introduz estresse externo a alguns organismos, como plantas4. Portanto, a implantação limitada de PL baseado em BioID em plantas (ou seja, protoplastos de arroz, Arabidopsis e N. benthamiana) foi relatada6,7,8,9. A enzima TurboID recentemente descrita supera as deficiências do PL. Turbo. TurboID, baseado em APEX e BioID, mostrou alta atividade que permite a realização de PL dentro de 10 min na RT10. O PL baseado em TurboID foi aplicado com sucesso em células, moscas e vermes10. Recentemente, nós e outros grupos de pesquisa otimizamos e ampliamos independentemente o uso de PL baseado em TurboID para estudar PPIs em diferentes sistemas vegetais, incluindo plantas n. benthamiana e arabidopsis e raízes peludas de tomate11,12,13,14. Análises comparativas indicaram que o TurboID tem melhor desempenho para pl em plantas em comparação com o BioID11,14. Também demonstrou a robustez do PL baseado em TurboID na planta, identificando uma série de novas interações com um receptor imunológico NLR11, uma proteína cujos parceiros de interação são geralmente difíceis de obter usando métodos tradicionais.
Este protocolo ilustra o PL baseado em TurboID na planta, descrevendo a identificação de proteínas de interação do domínio N-terminal TIR do receptor imunológico NLR em plantas n. benthamiana. O método pode ser estendido a quaisquer proteínas de interesse em N. benthamiana. Mais importante, fornece uma referência importante para investigar PPIs em outras espécies vegetais, como Arabidopsis,tomate e outras.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ligase de biotina TurboID é gerada pela evolução direcionada baseada em levedura do BioID10. Tem muitas vantagens sobre outras enzimas PL. TurboID permite a aplicação de PL em outros sistemas modelo, incluindo moscas e vermes, cuja temperatura de crescimento ideal é de cerca de 25 °C10. Embora a abordagem pl tenha sido amplamente utilizada em sistemas animais, sua aplicação em plantas é limitada. O protocolo descrito aqui fornece um procedimento passo-a-passo pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia Transgênica (2019ZX08010-003 para Y.Z.), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31872637 para Y.Z.), e dos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2019TC028 a Y.Z.), e NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 para S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Riferimenti
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