Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina
Summary
Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l’identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l’identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.
Abstract
Le tecniche di etichettatura di prossimità (PL) che utilizzano l’aossidasi ascorbate (APEX) ingegnerizzata o l’Escherichia coli biotini ligase ligase BirA (noto come BioID) sono state utilizzate con successo per l’identificazione delle interazioni proteina-proteina (IPP) nelle cellule dei mammiferi. Tuttavia, i requisiti di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in PL basato su APEX, tempi di incubazione più lunghi con biotina (16-24 h) e una temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) nel PL basato sul bioID limitano gravemente le loro applicazioni nelle piante. Il PL basato su TurboID recentemente descritto affronta molte limitazioni di BioID e APEX. TurboID consente una rapida etichettatura di prossimità delle proteine in soli 10 min in condizioni di temperatura ambiente (RT). Anche se l’utilità di TurboID è stata dimostrata in modelli animali, abbiamo recentemente dimostrato che PL a base di TurboID offre prestazioni migliori nelle piante rispetto al BioID per l’etichettatura delle proteine che sono propimali a una proteina di interesse. A questo proposito è fornito un protocollo passo-passo per l’identificazione dei partner di interazione proteica utilizzando il dominio del recettore N-terminale Toll/interleukin-1 (TIR) della famiglia di proteine leucina-ricca (NLR) legante-legame nucleotide come modello. Il metodo descrive la costruzione vettoriale, l’agroinfiltrazione dei costrutti di espressione proteica, il trattamento della biotina, l’estrazione e la dissalazione delle proteine, la quantificazione e l’arricchimento delle proteine biotinylate per purificazione dell’affinità. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per studiare altre proteine di interesse per Nicotiana e altre specie vegetali.
Introduction
Gli IPP sono alla base di vari processi cellulari. I metodi tradizionali per identificare gli IPP includono lo screening del lievito-due-ibrido (Y2H) e l’immunoprecipitazioni accoppiati con la spettrometria di massa (IP-MS)1. Tuttavia, entrambi soffrono di alcuni svantaggi. Ad esempio, lo screening Y2H richiede la disponibilità della libreria Y2H delle specie vegetali o animali bersaglio. La costruzione di queste biblioteche è laboriosa e costosa. Inoltre, l’approccio Y2H viene eseguito nel lievito eterologo dell’organismo eucatotico unidestro, che potrebbe non rappresentare lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori.
Al contrario, IP-MS mostra una bassa efficienza nell’acquisizione di IPP transitori o deboli, ed è anche inadatto per quelle proteine con bassa abbondanza o alta idrofobicità. Molte importanti proteine coinvolte nei percorsi di segnalazione delle piante, come le chinasi recettoriali (RLK) o la famiglia NLR di recettori immunitari, sono espresse a bassi livelli e spesso interagiscono con altre proteine in modo transitorio. Pertanto, limita notevolmente la comprensione dei meccanismi alla base della regolazione di queste proteine.
Recentemente, sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio degli Escherichia coli biotin ligase Ligase R118G (noto come BioID) metodi basati su ascorbate perossidasi ingegnerizzati (APEX) e un mutante Escherichia coli biotinli ligaseBirA R118G (noto come BioID) e utilizzati per lo studio degli IPP2,,3,4. Il principio di PL è che una proteina bersaglio di interesse è fusa con un enzima, che catalizza la formazione di labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Questi bio-AMP gratuiti vengono rilasciati dagli enzimi PL e si diffondono in prossimità della proteina bersaglio, permettendo la biotinyalazione delle proteine prossimali nelle ammine primarie entro un raggio stimato di 10 nm5.
Questo approccio presenta vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali Y2H e IP-MS, ad esempio la capacità di acquisire IPP temporanei o deboli. Inoltre, PL consente l’etichettatura delle proteine prossimali della proteina bersaglio nei loro ambienti cellulari nativi. Diversi enzimi PL hanno svantaggi unici quando li applicano a sistemi diversi. Ad esempio, sebbene APEX offra una cinetica di tagging più elevata rispetto al BioID e venga applicato con successo nei sistemi di mammiferi, il fabbisogno di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in questo approccio lo rende inadatto per gli studi PL negli impianti.
Al contrario, PL basato su BioID evita l’uso del tossico H2O2, ma il tasso di etichettatura è lento (che richiede 18-24 h per completare la biotinylation), rendendo così meno efficiente la cattura di PpI transitori. Inoltre, la temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) necessaria per un PL efficiente da parte di BioID introduce lo stress esterno ad alcuni organismi, come le piante4. Pertanto, è stato segnalatoun,7,8,9impiego limitato di PL a base di BioID in impianti (ad esempio protoplasti di riso, Arabidopsis e N. benthamiana) . L’enzima TurboID recentemente descritto supera le carenze di APEX e PL.10 PL basato su turboidi è stato applicato con successo nelle cellule dei mammiferi, mosche e vermi10. Recentemente, noi e altri gruppi di ricerca indipendenteottimizzato ed esteso l’uso di TurboID-based PL per studiare IPP in diversi sistemi vegetali, tra cui N. benthamiana e arabidopsis piante e pomodoro radici pelose11,12,13,14. Analisi comparative hanno indicato che TurboID offre prestazioni migliori per PL nelle piante rispetto al BioID11,14. Ha anche dimostrato la robustezza di PL a base di TurboID in planta identificando una serie di nuove interazioni con un recettore immunitario NLR11, una proteina i cui partner di interazione sono solitamente difficili da ottenere utilizzando metodi tradizionali.
Questo protocollo illustra il PL basato su TurboID in planta descrivendo l’identificazione delle proteine di interazione del dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR nelle piante Di N. benthamiana. Il metodo può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse in N. benthamiana. Ancora più importante, fornisce un importante riferimento per lo studio degli IPP in altre specie vegetali come l’Arabidopsis,il pomodoro e altri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il turboID biotina lega è generato dall’evoluzione diretta del BioID10basato sul display di lievito. Ha molti vantaggi rispetto ad altri enzimi PL. TurboID consente l’applicazione di PL ad altri sistemi di modello, tra cui mosche e vermi, la cui temperatura di crescita ottimale è di circa 25 c10. Anche se l’approccio PL è stato ampiamente utilizzato nei sistemi animali, la sua applicazione nelle piante è limitata. Il protocollo qui descritto fornisce una procedura passo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Transgenic Science and Technology Program (2019-X08010-003 a Y.z.), della National Natural Science Foundation of China (31872637 a Y.z.) e dei Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (da 2019TC028 a Y.E.) e della NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Riferimenti
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