단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링
Summary
여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.
Abstract
근접 라벨링(PL) 기술은 엔지니어링된 아스코르브베이트 과산화수배 (APEX) 또는 대장균 비오틴 리가제 비라(BioID로 알려짐)를 사용하여 포유류 세포에서 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 식별하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 APEX 기반 PL에서2독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항, 비오틴(16-24시간)의 배양 시간 연장, BioID 기반 PL의 더 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물에서의 적용을 심각하게 제한합니다. 최근에 설명된 TurboID 기반 PL은 BioID 및 APEX의 많은 한계를 해결합니다. TurboID는 실온(RT) 조건에서 단 10분 만에 단백질의 신속한 근접 라벨링을 허용합니다. TurboID의 유용성은 동물 모델에서 입증되었지만, 우리는 최근 터보 ID 기반 PL이 관심있는 단백질에 근접한 단백질의 라벨링에 대한 BioID에 비해 식물에서 더 나은 성능을 보였다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 뉴클레오티드 결합 류신-리치 반복(NLR) 단백질 패밀리의 N-말단 톨/인터류키핀-1 수용체(TIR) 도메인을 이용하여 단백질 상호작용 파트너의 식별을 위한 단계별 프로토콜이다. 이 방법은 친화도 정제에 의한 생체 연단백질의 벡터 구성, 단백질 발현 구조, 비오틴 처리, 단백질 추출 및 탈염, 정량화 및 농축에 대해 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 니코티아나 및 다른 식물 종에서 관심 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.
Introduction
PPI는 다양한 세포 과정의 기초입니다. PPI를 확인하기 위한 전통적인 방법은 질량 분석법 (IP-MS)와 결합된 효모 2 하이브리드 (Y2H) 검열 및 면역침전을 포함합니다 1. 그러나 둘 다 몇 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 예를 들어, Y2H 스크리닝은 표적 식물 또는 동물 종의 Y2H 라이브러리의 가용성을 요구한다. 이 도서관의 건설은 노동 집약적이고 비싸다. 더욱이, Y2H 접근법은 더 높은 진핵 세포의 세포 상태를 나타내지 않을 수 있는 이종 단세포 진핵 생물 효모에서 수행된다.
대조적으로, IP-MS는 일시적 또는 약한 PPI를 포착하는 데 있어 낮은 효율을 나타내며, 또한 낮은 풍부하거나 높은 소수성을 가진 단백질에 적합하지 않다. 수용체 같이 키나아제 (RLKs) 또는 면역 수용체의 NLR 가족과 같은 식물 신호 통로에서 관련시킨 많은 중요한 단백질은 낮은 수준에서 표현되고 수시로 그밖 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서, 그것은 크게 이러한 단백질의 조절의 기본 메커니즘의 이해를 제한.
최근에는 엔지니어링된 아스코르베이트 과산화수산아제(APEX)와 돌연변이 대장균 리게틴 리가제 비라R118G(BioID로 알려짐)에 기초한 근접 라벨링(PL) 방법이 개발되어 PPIs2,3,4의,4연구에 활용되고 있다. PL의 원리는 관심있는 표적 단백질이 효소와 융합되어 비질 바이오티닐-AMP(bio-AMP)의 형성을 촉매한다는 것입니다. 이러한 자유 바이오-AMP는 PL 효소에 의해 방출되고 표적 단백질 부근으로 확산되어 10 nm5의추정 반경 내에 있는 1차 아민에서 근위 단백질의 생체측을 허용한다.
이 접근법은 과도 또는 약한 PPI를 캡처하는 기능과 같은 기존의 Y2H 및 IP-MS 접근 방식에 비해 상당한 이점이 있습니다. 더욱이, PL은 그들의 모국세포 환경에서 표적 단백질의 근위 단백질의 라벨링을 허용한다. 다른 PL 효소는 다른 시스템에 적용할 때 독특한 단점이 있습니다. 예를 들어, APEX는 BioID에 비해 더 높은 태깅 역학을 제공하고 포유류 시스템에 성공적으로 적용되지만,2이 접근법에서 독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항은 식물의 PL 연구에 적합하지 않습니다.
대조적으로, BioID 기반 PL은 독성H2O2의사용을 피하지만 라벨링 속도가 느립니다 (생체 이식을 완료하기 위해 18-24 시간이 필요함) 따라서 과도 PPI의 캡처가 덜 효율적입니다. 더욱이, BioID에 의한 효율적인 PL에 필요한 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물4와같은 일부 유기체에 외부 스트레스를 유발한다. 따라서 식물(즉, 쌀 톱니세포, 애기장대 및 N. 벤타미아나)에서 BioID 기반 PL의 제한된 배치가6,7,78,9로보고되었다.,8 최근 기술된 터보ID 효소는 APEX 및 BioID 기반 PL. TurboID의 결핍을 극복하여 RT10에서10분 이내에 PL을 성취할 수 있는 높은 활성을 보였다. TurboID 기반 PL은 포유류 세포, 파리 및 웜10에성공적으로 적용되었습니다. 최근, 당사및 기타 연구그룹은 N. 벤타미아나 및, 애기장대 식물 및 토마토 털뿌리11,12,13,,,14를포함한 다양한 식물 시스템에서 PPI를 연구하기 위한 TurboID 기반 PL의 사용을 독립적으로 최적화및 확장시켰다. 비교 분석에 따르면 TurboID는 BioID11,,14에비해 식물에서 PL에 대해 더 나은 성능을 보입니다. 또한 전통적인 방법을 사용하여 얻기 어려운 상호 작용 파트너가 일반적으로 어려운 NLR 면역 수용체11과의 새로운 상호 작용의 수를 확인함으로써 질라에서 TurboID 기반 PL의 견고성을 입증했습니다.
이 프로토콜은 N. 벤타미아나 식물에서 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인의 상호작용 단백질의 식별을 설명함으로써 질라에서 터보ID 기반 PL을 설명한다. 이 방법은 N. 벤타미아나에관심있는 모든 단백질로 확장 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 애기장대등 다른 식물 종에서 PPI를 조사에 대 한 중요 한 참조를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
터보ID 비오틴 리가제는 바이오ID10의효모 디스플레이 기반 의 방향 진화에 의해 생성된다. 그것은 다른 PL 효소에 비해 많은 장점을 갖는다. TurboID는 최적의 성장 온도가 약 25 °C10인파리와 웜을 포함한 다른 모델 시스템에 PL을 적용 할 수 있습니다. PL 접근법은 동물 시스템에서 널리 사용되어 왔지만 식물에서의 적용은 제한적입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 국립 트랜스제닉 과학 기술 프로그램(2019ZX08010-003 ~ Y.Z.), 중국 국립 자연과학 재단(31872637 ~ Y.Z.), 중앙대학 기초연구기금(2019TC028 ~Y.Z.), NSF-IOS-1344의 보조금으로 지원되었다. NSF-IOS-1339185 및 NIH-GM132582-01~ S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Riferimenti
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