לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי
Summary
אנו מתארים שיטת ה-PCR הכמותית וכמותית ללוקליזציה וכימות של וירוסים ברקמות החרקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללונציה כדי להתאים חלבונים וקטוריים ומוקטורים. הפרוטוקול PCR כמותי ניתן להאריך כדי לכמת וירוסים בגופים שלמים כנימה וצמחים נגועים בווירוס.
Abstract
וירוסים (סוג של וירוס, משפחה גמביתיים) משודרים על ידי ויטאווניים של מתחם הטבק הבומיסיה באופן מתמשך, circulative. בהתחשב בנזק הנרחב שנגרם על-ידי וירוסים לחיתוך הייצור ברחבי העולם, זה הכרחי להבין את האינטראקציה בין וירוסים באגאוטיות לבין וקטור כנימה שלהם. לשם כך, לוקליזציה וקוונפיקציה של הנגיף ברקמות וקטורי הוא קריטי. כאן, באמצעות עגבניה צהוב עלה וירוס תלתל (TYLCV) כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי להתאים וירוסים בתוך מידות בינוני, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות על ידי immunofluorescence. השיטה מבוססת על שימוש בנוגדנים ספציפיים נגד חלבון מעיל וירוס, נוגדנים משניים המסומנים בצבע, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנו מתארים עוד פרוטוקול עבור כימות של TYLCV ב midefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, המוליקמ, והשחלות על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). באמצעות התחל שתוכנן במיוחד עבור TYLCV, הפרוטוקולים עבור כימות לאפשר השוואה של כמות TYLCV ברקמות שונות של הלבנה. הפרוטוקול המתואר הוא שימושי פוטנציאל לכמת של וירוסים בתוך הגוף של להלבין ומפעל נגוע בווירוס. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול המחזור של וירוסים בהאגאוטיות ב כנימה או כהשלמה לשיטות אחרות כדי ללמוד אינטראקציות וירוס להלבין.
Introduction
בעשורים האחרונים, וירוסים (סוג של וירוסבימודוללי, משפחה גמניריתיים) גרמו נזק חמור לייצור של ירקות רבים, סיבים, וגידולים דקורטיביים ברחבי העולם1. וירוסים משודרים באופן מתמשך על ידי המיסיה הבוטטיות של הטבק , שהוא מינים מורכבים המכילים מעל 35 מינים מסתורית2,3. וירוסים יכול להשפיע ישירות או בעקיפין על פיזיולוגיה והתנהגות של כנימה, כגון פוריות4, אריכות ימים4, והעדפה מארחים5,6. יתר על כן, את היעילות השידור של מינים וירוסים מסוג מסוים/זן משתנה עבור מינים שונים הנסתר להלבין גם תחת אותם תנאים ניסיוני7,8,9,10, המציין כי יש אינטראקציה מורכבת בין וירוסים באגאוטיות ו כנימה. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבבסיס האינטראקציות להלבין וירוס, לוקליזציה וכימות הווירוס ברקמות כנימה חיוניים.
עגבניות העלה צהוב וירוס תלתל (TYLCV) הוא וירוס באגאומודוללי שדווחו לראשונה בישראל אך כיום גורם נזק חמור לייצור עגבניות ברחבי העולם11,12. בשל חשיבותו הכלכלית, הוא אחד הווירוסים הטובים ביותר שנחקרו13. כמו אחרים וירוסים באגאופית אחרים, TYLCV הוא וירוס בודד ומעגלי DNA עם גודל הגנום של כ 2,800 נוקלאוטידים14. תוך כדי דיון, כמה שורות של ראיות תומכות השכפול של TYLCV ב whiteflies15,16,17. יתר על כן, האינטראקציה של חלקיקים TYLCV וחלבונים כנימה דווחו6,18,19,20. עבור העברת וירוסים, whiteflies לרכוש TYLCV על ידי האכלה על צמחים נגועים וירוס, הרימונים לעבור לאורך תעלת המזון כדי להגיע הוושט, לחדור את הקיר באמצע המעיים כדי להגיע המוליקמ, ולאחר מכן העברת לתוך בלוטות הרוק הראשי (PSGs). לבסוף, הריטונים מואגרים עם רוק לאורך תעלת הרוק לתוך הצמח שיפה21. יתרה מזאת, מספר מחקרים מראים כי TYLCV מסוגל להיות transovarially ששודרו נקבה whiteflies לצאצאיהם22,23. במילים אחרות, כדי להשיג שידור פרודוקטיבי, הווירוס יש להתגבר על מחסומים סלולריים בתוך הלבנה כדי לאתר מרקמה אחת לאחרת. במהלך המעבר של מחסומים אלה, האינטראקציות בין חלבונים להלבין ווירוסים צפויים להתרחש, כנראה קביעת היעילות שבה הווירוסים משודרים.
אימונואופלובורנציה היא טכניקה נפוצה לניתוח הפצת חלבונים. הספציפיות של כריכת נוגדנים לאנטיגן שלהם מהווים את הבסיס לאימונולובורנציה. בשל המשמעות הכלכלית של TYLCV, נוגדנים חד שבטיים נגד חלבון הפרווה TYLCV פותחו, המציע דרך רגישה מאוד כדי להתאים את הווירוס24. ה-PCR הכמותי (qPCR) מאפשר כימות רגישות וספציפיות של חומצות גרעין. טכניקה זו מבוססת בתדירות גבוהה על השימוש במחקר הידרוליזה (למשל, TaqMan) או צבע פלורסנט (למשל, SYBR גרין) זיהוי. עבור הידרוליזה בדיקה qPCR מבוססי, הבדיקות הספציפיות הם נחוצים, אשר כתוצאה מכך להגדיל את העלות. פלורסנט מבוססי לצבוע qPCR הוא פשוט יותר וחסכוני יותר, כי התווית בדיקה היברידיתים ספציפיים של הכלאה אינם נדרשים25. עד כה, מספר מחקרים השתמשו immunofluorescence ו qPCR יחד עם שיטות אחרות כדי לחקור את הקשר המורכב וירוס מורכב ולהלבין. לדוגמה, פאן et al ביצע qpcr ניתוח אימונוoforסנס של הנגיף ברקמות כנימה ומצא כי ההבדל ביכולת לשדר טבק מתולתל לירות וירוס (tbcsv) בין מינים כנימה asiaii 1 ואת המזרח התיכון אסיה מינור 1 (MEAM1) היה בשל הווירוס להיות מסוגל ביעילות לחצות אתהקיר פיתול של באופן דומה, בעוד הים התיכון (MED) להלבין יכול בקלות להעביר TYLCV, הם נכשלים לשדר עגבניות עלה צהוב תלתל וירוס בסין (TYLCCNV). שידור סלקטיבי נחקר באמצעות זיהוי immunofluorescence של וירוס ב-PSGs, אשר הראה כי TYLCCNV לא בקלות לחצות את PSGs של MED להלבין26. Immunofluorescence לוקליזציה של TYLCV CP ואת החלבון האוטומטי סמן הסימון ATG8-II ב-midefly המעיים מראה כי באופן אוטומטי משחק תפקיד קריטי ב לדכא את הזיהום של TYLCV ב-27whitly.
כאן, באמצעות TYLCV כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול עבור הלוקליזציה של וירוסים באגאוטיות ב מידולי מידות, PSGs, והשחלות על ידי טכניקה immunofluorescence. הטכניקה כוללת ניתוח, קיבוע ודגירה עם נוגדנים משניים בעלי התווית הראשית והצבע. אותות פלואורסצנטית מראה את המיקום של חלבונים ויראלי ברקמות להלבין ניתן לזהות במיקרוסקופ קונפוקלית וקד. חשוב מכך, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנחנו עוד לתאר את הפרוטוקול עבור כימות TYLCV באמצעות מבוססי sybr הירוק qpcr ב-midefly מידות, psgs, המוליקמ, והשחלות, כי ניתן להשתמש כדי להשוות את כמות הווירוס בדגימות שונות רקמת כנימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור לוקליזציה וכימות של וירוס באגאוטיות ברקמות של וקטור להלבין שלה על ידי immunofluorescence סנס ו-qPCR. חיתוך מייצג את הצעד הראשון לוקליזציה ולכמת את הנגיף ברקמות להלבין. הגוף הלבן הוא כ 1 מ”מ באורך, כלומר הרקמות קטנות מאוד, וקשה לנתח אותם. חוץ מזה, יש קשרים. חזקים בין הרקמות לד…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (מספר גרנט: 2017YFD0200600), הקרן מיועד למחקר החקלאות סין מערכת (מספר מענק: מכוניות 23-D07) ואת ביל & מלינדה גייטס קרן (מזהה השקעה OPP1149777 ). אנו מודים לפרופסור ג’יאן-שיאנג וו למתן נוגדנים TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
