Lokalisering og kvantificering af Begomovirus i Whitefly Væv ved immunfluorescens og kvantitativ PCR
Summary
Vi beskriver en immunfluorescens og kvantitativ PCR-metode til lokalisering og kvantificering af begomovirus i insektvæv. Immunofluorescensprotokollen kan bruges til at colocalize virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokol kan udvides til at kvantificere virus i hele whitefly organer og virus-inficerede planter.
Abstract
Begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)overføres af whiteflies af Bemisia tabaci kompleks i en vedvarende, cirkulerende måde. I betragtning af de omfattende skader forårsaget af begomovirus til afgrødeproduktion på verdensplan, er det bydende nødvendigt at forstå samspillet mellem begomovirus og deres whitefly vektor. For at gøre dette, lokalisering og kvantificering af virus i vektorvæv er afgørende. Her, ved hjælp af tomat gul blad krølle virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljeret protokol til at lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spytkirtler, og æggestokke ved immunfluorescens. Metoden er baseret på brugen af specifikke antistoffer mod et viruscoatprotein, farvemærkede sekundære antistoffer og et konfokalmikroskop. Protokollen kan også bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV i whitefly midguts, primære spytkirtler, hæmolymfe og æggestokke efter kvantitativ PCR (qPCR). Ved hjælp af primere specielt designet til TYLCV, protokollerne til kvantificering tillader sammenligning af mængden af TYLCV i forskellige væv af whitefly. Den beskrevne protokol er potentielt nyttig til kvantificering af begomovirus i kroppen af en whitefly og en virus-inficeret plante. Disse protokoller kan bruges til at analysere cirkulation stil en begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder til at studere whitefly-begomovirus interaktioner.
Introduction
I de sidste årtier, begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)har forårsaget alvorlige skader på produktionen af mange vegetabilske, fiber, og prydafgrøder på verdensplan1. Begomovirus overføres på en vedvarende måde af whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art, der indeholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og adfærd, såsom frugtbarhed4,levetid4,og vært præference5,6. Desuden varierer transmissionseffektiviteten af en given begomovirusart/stamme for forskellige hvidflyvekryptiske arter, selv under de samme forsøgsbetingelser7,8,9,10, hvilket indikerer, at der er et komplekst samspil mellem begomovirus og hvidfluer. For bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering og kvantificering af virus i whitefly væv er afgørende.
Tomat gul blad krølle virus (TYLCV) er en begomovirus, der først blev rapporteret i Israel, men i dag forårsager alvorlige skader på tomat produktion på verdensplan11,12. På grund af sin økonomiske betydning, det er en af de bedst undersøgte begomovirus13. Ligesom andre monopartit begomovirus er TYLCV en cirkulær DNA-virus med en enkeltstrengs cirkulær DNA-virus med en genomstørrelse på ca. 2.800 nukleotider14. Mens der stadig er under debat, flere linjer af beviser understøtter replikering af TYLCV i whiteflies15,16,17. Desuden er samspillet mellem TYLCV-partikler og whiteflyproteiner rapporteret6,18,19,20. For virus transmission, whiteflies erhverve TYLCV ved fodring på virus-inficerede planter, virioner passere langs fødevarekanalen for at nå spiserøret, trænge ind i midgut væggen for at nå hæmolymfen, og derefter flytte ind i den primære spytkirtler (PSGs). Endelig er virioner egested med spyt langs spytkanalen i plantphloem21. Endvidere viser flere undersøgelser, at TYLCV er i stand til at overføres fra kvindelige hvidefluer til deres afkom22,23. Med andre ord, for at opnå produktiv transmission, virus har til at overvinde cellulære barrierer i whitefly at flytte fra et væv til et andet. Under passagen af disse barrierer, interaktioner mellem whitefly og virus proteiner vil sandsynligvis forekomme, sandsynligvis bestemme den effektivitet, hvormed virus overføres.
Immunfluorescens er en almindeligt anvendt teknik til proteinfordelingsanalyse. Specificiteten af antistoffer, der er bindende for deres antigen, danner grundlag for immunfluorescens. På grund af den økonomiske betydning af TYLCV, monoklonale antistoffer mod TYLCV pels protein er blevet udviklet, tilbyder en meget følsom måde at lokalisere virus24. Kvantitativ PCR (qPCR) muliggør følsom og specifik kvantificering af nukleinsyrer. Denne teknik er oftest baseret på anvendelse af hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende farvestof (f.eks. For hydrolyse sonde-baserede qPCR, er der behov for specifikke sonder, hvilket derfor øger omkostningerne. Fluorescerende farvestof-baserede qPCR er enklere og mere omkostningseffektiv, fordi mærket amplicon-specifikke hybridisering sonder ikke er påkrævet25. Hidtil, flere undersøgelser har brugt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder til at undersøge de komplekse begomovirus-whitefly interaktioner. For eksempel udførte Pan et al. qPCR og immunfluorescensanalyse af virus i whiteflyvæv og fandt, at forskellen i evnen til at overføre tobak krøllet skyde virus (TbCSV) mellem whitefly arter AsiaII 1 og Mellemøsten Asien Minor 1 (MEAM1) skyldtes virus er i stand til effektivt at krydse midgut væggen i AsiaII1, men ikke MEAM18. Tilsvarende, mens Middelhavet (MED) whiteflies let kan overføre TYLCV, de undlader at overføre tomat gul blad krølle Kina virus (TYLCCNV). Selektiv overførsel blev undersøgt ved hjælp af immunfluorescenspåvisning af virus i PSG’erne, som viste, at TYLCCNV ikke let krydser PSG’erne i MED whiteflies26. Immunfluorescens colokalisering af TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser, at autofagi spiller en afgørende rolle i at undertrykke infektionen af TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjælp af TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokol for lokalisering af begomovirus i whitefly midguts, PSGs, og æggestokke ved en immunfluorescens teknik. Teknikken omfatter dissektion, fiksering og inkubation med primære og farvemærkemærkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler, der viser placeringen af virale proteiner i whitefly-vævene, kan derefter påvises under et konfokalmikroskop. Endnu vigtigere, denne protokol kan bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV ved hjælp af SYBR Green-baserede qPCR i whitefly midguts, PSGs, hæmolymfe og æggestokke, der kan bruges til at sammenligne mængden af virus i forskellige whitefly vævsprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokol for lokalisering og kvantificering af en begomovirus i væv af sin whitefly vektor ved immunfluorescens og qPCR. Dissektion repræsenterer det første skridt til at lokalisere og kvantificere virus i whitefly væv. Den whitefly krop er omkring 1 mm i længden, hvilket betyder, at væv er ekstremt små, og det er svært at dissekere dem. Desuden er der stærke forbindelser mellem væv. For eksempel er æggestokkene tæt forbundet med bakteriokytter, hvilket gør dem vanskelige at isolere. Her …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), den øremærkede fond for China Agriculture Research System (tilskudsnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for at give TYLCV CP antistoffer.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
