Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR
Summary
We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.
Abstract
Begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae) worden overgedragen door witte vliegen van de Bemisia tabaci complex in een aanhoudende, circulerende manier. Gezien de grote schade veroorzaakt door begomovirussen aan de productie van gewassen wereldwijd, is het noodzakelijk om de interactie tussen begomovirussen en hun wittevliegvector te begrijpen. Om dit te doen, lokalisatie en kwantificering van het virus in de vectorweefsels is van cruciaal belang. Hier, met behulp van tomaat geel blad krul virus (TYLCV) als voorbeeld, beschrijven we een gedetailleerd protocol om begomovirussen lokaliseren in wittevlieg midguts, primaire speekselklieren, en eierstokken door immunofluorescentie. De methode is gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen tegen een viruscoat eiwit, kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen, en een confocale microscoop. Het protocol kan ook worden gebruikt om begomovirale en wittevliegeiwitten te colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV in wittevliegmiddeningewanden, primaire speekselklieren, hemolymph en eierstokken door kwantitatieve PCR (qPCR). Met behulp van primers speciaal ontworpen voor TYLCV, de protocollen voor kwantificering maken de vergelijking van de hoeveelheid TYLCV in verschillende weefsels van de wittevlieg. Het beschreven protocol is potentieel nuttig voor de kwantificering van begomovirussen in het lichaam van een wittevlieg en een met virussen geïnfecteerde plant. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de circulatieroute van begomovirussen in de wittevlieg te analyseren of als aanvulling op andere methoden om wittevlieg-begomovirus interacties te bestuderen.
Introduction
In de afgelopen decennia hebben begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae)ernstige schade toegebracht aan de productie van vele plantaardige, vezel- en siergewassen wereldwijd1. Begomovirussen worden op een hardnekkige manier overgedragen door de witte vlieg Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), een complexe soort met meer dan 35 cryptische soorten2,3. Begomovirussen kunnen direct of indirect invloed hebben op de fysiologie en het gedrag van witte vlieg, zoals vruchtbaarheid4,levensduur4en gastheervoorkeur5,6. Bovendien varieert de transmissie-efficiëntie van een bepaalde begomovirussoort/-soort voor verschillende wittevliegcryptische soorten, zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden7,8,9,10, wat aangeeft dat er een complexe interactie is tussen begomovirussen en witte vliegen. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan wittevlieg-begomovirus interacties beter te begrijpen, lokalisatie en kwantificering van het virus in wittevliegweefsels zijn essentieel.
Tomaat geel blad krul virus (TYLCV) is een begomovirus dat voor het eerst werd gemeld in Israël, maar tegenwoordig veroorzaakt ernstige schade aan de tomatenproductie wereldwijd11,12. Vanwege het economische belang is het een van de best bestudeerde begomovirussen13. Net als andere monopartite begomovirussen, TYLCV is een single-streng cirkel-DNA-virus met een genoom grootte van ongeveer 2.800 nucleotiden14. Hoewel nog steeds in debat, verschillende lijnen van bewijs ondersteunen de replicatie van TYLCV in whiteflies15,16,17. Bovendien is de interactie van TYLCV-deeltjes en wittevliegeiwitten gerapporteerd6,18,19,20. Voor virusoverdracht verwerven witte vliegen TYLCV door zich te voeden met virusgeïnfecteerde planten, passeren virions langs het voedselkanaal om de slokdarm te bereiken, dringen ze de midgutwand binnen om de hemolymph te bereiken en vervolgens over te plaatsen in de primaire speekselklieren (PSG’s). Ten slotte worden virions met speeksel langs het speekselkanaal in plantenphloem21ingenomen. Bovendien tonen verschillende studies aan dat TYLCV transovarially kan worden overgedragen van vrouwelijke wittevliegen naar hun nakomelingen22,23. Met andere woorden, om productieve transmissie te bereiken, moet het virus cellulaire barrières binnen de witte vlieg overwinnen om van het ene weefsel naar het andere te translokaliseren. Tijdens het oversteken van deze barrières zullen interacties tussen wittevlieg- en viruseiwitten waarschijnlijk optreden, waarschijnlijk het bepalen van de efficiëntie waarmee de virussen worden overgedragen.
Immunofluorescentie is een veelgebruikte techniek voor eiwitdistributieanalyse. De specificiteit van antilichamen die aan hun antigeen zijn gebonden, vormt de basis van immunofluorescentie. Vanwege de economische betekenis van TYLCV zijn monoklonale antilichamen tegen het TYLCV-vachteiwit ontwikkeld, die een zeer gevoelige manier bieden om het virus te lokaliseren24. Kwantitatieve PCR (qPCR) maakt gevoelige en specifieke kwantificering van nucleïnezuren mogelijk. Deze techniek is het vaakst gebaseerd op het gebruik van hydrolyse sonde (bijvoorbeeld TaqMan) of fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld SYBR Green) detectie. Voor qPCR op basis van hydrolysesonis zijn specifieke sondes nodig, waardoor de kosten stijgen. Fluorescerende kleurstof gebaseerde qPCR is eenvoudiger en kosteneffectiever, omdat gelabeld amplicon-specifieke hybridisatie sondes zijn niet vereist25. Tot nu toe hebben verschillende studies immunofluorescentie en qPCR gebruikt, samen met andere methoden om de complexe interacties tussen begomovirus-whitefly te onderzoeken. Pan et al. voerde bijvoorbeeld qPCR- en immunofluorescentieanalyse van het virus in wittevliegweefsels uit en constateerde dat het verschil in vermogen om tabakskrullend scheutvirus (TbCSV) tussen wittevliegsoorten AsiaII 1 en Minor 1 in Het Midden-Oosten (MEAM1) over te brengen, te wijten was aan het feit dat het virus efficiënt de midgutwall van AsiaII1 maar meam18kon oversteken. Op dezelfde manier, terwijl mediterrane (MED) witte vliegen gemakkelijk Kan verzenden TYLCV, ze niet aan tomaat gele blad krul China virus (TYLCCNV) overbrengen. Selectieve overdracht werd onderzocht aan de hand van immunofluorescentiedetectie van het virus in de PSG’s, waaruit bleek dat TYLCCNV niet gemakkelijk de PSGs van MED-witvliegen kruist26. Immunofluorescentie colokalisatie van TYLCV CP en de autofagie marker eiwit ATG8-II in wittevlieg midguts blijkt dat autofagie speelt een cruciale rol bij het onderdrukken van de infectie van TYLCV in de wittevlieg27.
Hier beschrijven we met Behulp van TYLCV als voorbeeld een protocol voor de lokalisatie van begomovirussen in wittevliegdwergen, PSGs en eierstokken door middel van een immunofluorescentietechniek. De techniek omvat dissectie, fixatie, en incubatie met primaire en kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen. Fluorescentiesignalen die de locatie van virale eiwitten in de wittevliegweefsels laten zien, kunnen vervolgens worden gedetecteerd onder een confocale microscoop. Wat nog belangrijker is, kan dit protocol worden gebruikt om begomovirale en wittevliegproteïnen colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV met behulp van SYBR Green-based qPCR in whitefly midguts, PSGs, hemolymph, en eierstokken, die kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid virus te vergelijken in verschillende wittevliegweefsel monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de lokalisatie en kwantificering van een begomovirus in de weefsels van zijn wittevliegvector door immunofluorescentie en qPCR. Dissectie is de eerste stap om het virus in wittevliegweefsels te lokaliseren en te kwantificeren. De wittevlieg lichaam is ongeveer 1 mm lang, wat betekent dat de weefsels zijn zeer klein, en het is moeilijk om ze te ontleden. Bovendien zijn er sterke verbindingen tussen de weefsels. De eierstokken zijn bijvoorbeeld nauw verbonden met de bacteriocyten, waar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), het geoormerkte fonds voor China Agriculture Research System (subsidienummer: CARS-23-D07) en de Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Wij danken Prof. Jian-Xiang Wu voor het verstrekken van TYLCV CP antilichamen.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
