प्रतिरक्षण और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा व्हाइटफ्लाई ऊतकों में बेगोमोवायरस का स्थानीयकरण और परिमाणीकरण
Summary
हम कीट ऊतकों में बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण और मात्राकरण के लिए एक प्रतिरक्षण और मात्रात्मक पीसीआर विधि का वर्णन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग वायरल और वेक्टर प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जा सकता है। मात्रात्मक पीसीआर प्रोटोकॉल को पूरे व्हाइटफ्लाई निकायों और वायरस से संक्रमित पौधों में वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
बेगोमोवायरस (जीनस बेगोमोवायरस,परिवार जेमिनीविरीडी)लगातार, संचारित तरीके से बेमिसिया तबसी परिसर के सफेद मक्खियों द्वारा प्रेषित किए जाते हैं। दुनिया भर में फसल उत्पादन के लिए begomoviruses की वजह से व्यापक नुकसान को ध्यान में रखते हुए, यह begomoviruses और उनके whitefly वेक्टर के बीच बातचीत को समझने के लिए जरूरी है । ऐसा करने के लिए, वेक्टर ऊतकों में वायरस का स्थानीयकरण और मात्राकरण महत्वपूर्ण है। यहां, एक उदाहरण के रूप में टमाटर पीले पत्ते कर्ल वायरस (TYLCV) का उपयोग करके, हम प्रतिकार द्वारा व्हाइटफ्लाई मिडगुट, प्राथमिक लार ग्रंथियों और अंडाशय में बेगोमोवायरस को स्थानीयकृत करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विधि एक वायरस कोट प्रोटीन, रंगलेबल माध्यमिक एंटीबॉडी, और एक confocal माइक्रोस्कोप के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित है । प्रोटोकॉल का उपयोग बेगोमोवायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए भी किया जा सकता है। हम आगे व्हाइटफ्लाई मिडगुट, प्राथमिक लार ग्रंथियों, हीमोलिमीलफ, और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा अंडाशय में TYLCV के परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । विशेष रूप से TYLCV के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके, क्वांटिफिकेशन के लिए प्रोटोकॉल व्हाइटफ्लाई के विभिन्न ऊतकों में टायलसीवी की मात्रा की तुलना की अनुमति देते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल एक व्हाइटफ्लाई और वायरस संक्रमित पौधे के शरीर में बेगोमोवायरस के परिमाणीकरण के लिए संभावित रूप से उपयोगी है। इन प्रोटोकॉलका उपयोग व्हाइटफ्लाई में बेगोमोवायरस के परिसंचरण मार्ग का विश्लेषण करने या व्हाइटफ्लाई-बेगोमोवायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों के पूरक के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
पिछले दशकों में, बेगोमोवायरस (जीनस बेगोमोवायरस,परिवार जेमिनीविरीडी)नेदुनियाभर में कई सब्जी, फाइबर और सजावटी फसलों के उत्पादन को गंभीर नुकसान पहुंचाया है। बेगोमोवायरस व्हाइटफ्लाई बेमिसिया तबसी (हेमिप्टेरा: एलेरोडिडी) द्वारा लगातार तरीके से फैलते हैं, जो एक जटिल प्रजाति है जिसमें 35 गुप्त प्रजातियां2,3से अधिक होती हैं। बेगोमोवायरस प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से व्हाइटफ्लाई फिजियोलॉजी और व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि फेकंडिटी4,दीर्घायु4,और मेजबान वरीयता5,6। इसके अलावा, एक दिए गए बेगोमोवायरस प्रजातियों/तनाव की संचरण दक्षता विभिन्न सफेद मक्खी गुप्त प्रजातियों के लिए भी एक ही प्रयोगात्मक परिस्थितियोंमें 7,8,9,10,यह दर्शाता है कि वहां begomoviruss और whiteflies के बीच एक जटिल बातचीत है बदलता है । व्हाइटफ्लाई-बेगोमोवायरस इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्रको बेहतर ढंग से समझने के लिए, व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस का स्थानीयकरण और मात्राकरण आवश्यक है।
टमाटर पीली पत्ती कर्ल वायरस (TYLCV) एक बेगोमोवायरस है जो पहले इसराइल में सूचित किया गया था, लेकिन आजकल11,12दुनिया भर में टमाटर के उत्पादन को गंभीर नुकसान पहुंचाता है । इसके आर्थिक महत्व के कारण, यह सबसे अच्छा अध्ययन begomoviruses13में से एक है । अन्य मोनोपार्टिट बेगोमोवायरस की तरह, टायलसीवी एक एकल-स्ट्रैंड गोलाकार डीएनए वायरस है जिसका जीनोम आकार लगभग 2,800 न्यूक्लियोटाइड्स14है। हालांकि अभी भी बहस चल रही है, सबूतों की कई पंक्तियां व्हाइटफ्लियों15,16,17में टायलसीवी की प्रतिकृति का समर्थन करती हैं । इसके अलावा,6 , 18,19,20के बारे में टीएलसीवी कणों और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन की बातचीतकीसूचना दी गई है । वायरस संचरण के लिए, व्हाइटफ्लियों वायरस संक्रमित पौधों पर भोजन करके TYLCV प्राप्त करते हैं, घेघा तक पहुंचने के लिए खाद्य नहर के साथ विरशन गुजरते हैं, हीमोलिम्फ तक पहुंचने के लिए मिडगट दीवार में प्रवेश करते हैं, और फिर प्राथमिक लार ग्रंथियों (पीएसजी) में स्थानांतरित करते हैं। अंत में, विरियन को लार डक्ट के साथ लार के साथ पौधे के फ्लोएम21में रखा जाता है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से पता चलता है कि TYLCV महिला व्हाइटफ्लियों से उनकीसंतान2,23तक ट्रांसवाइज रूप से प्रेषित करने में सक्षम है। दूसरे शब्दों में, उत्पादक संचरण प्राप्त करने के लिए, वायरस को एक ऊतक से दूसरे में स्थानांतरित करने के लिए व्हाइटफ्लाई के भीतर सेलुलर बाधाओं को दूर करना पड़ता है। इन बाधाओं के पार करने के दौरान, व्हाइटफ्लाई और वायरस प्रोटीन के बीच बातचीत होने की संभावना है, शायद दक्षता का निर्धारण जिसके साथ वायरस प्रेषित होते हैं।
प्रतिरक्षण प्रोटीन वितरण विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक है। उनके एंटीजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रतिरक्षण का आधार बनाती है। TYLCV के आर्थिक महत्व के कारण, TYLCV कोट प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकसित किया गया है, वायरस24स्थानीयकरण के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका प्रदान करता है । मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) न्यूक्लिक एसिड के संवेदनशील और विशिष्ट मात्राकरण की अनुमति देता है। यह तकनीक हाइड्रोलाइसिस जांच (जैसे, TaqMan) या फ्लोरोसेंट डाये (जैसे, SYBR ग्रीन) का पता लगाने के उपयोग पर सबसे अधिक बार आधारित है। हाइड्रोलिस जांच आधारित क्यूपीसीआर के लिए विशिष्ट जांच की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप लागत में वृद्धि होती है । फ्लोरोसेंट डाया आधारित क्यूपीसीआर सरल और अधिक लागत प्रभावी है, क्योंकि लेबल वाले एम्प्लिस-विशिष्ट संकरण जांच की आवश्यकता नहीं है25। अब तक, कई अध्ययनों ने जटिल बेगोमोवायरस-व्हाइटफ्लाई इंटरैक्शन की जांच करने के लिए अन्य तरीकों के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और क्यूपीसीआर का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, पैन एट अल ने व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस के क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण किया और पाया कि व्हाइटफ्लाई प्रजातियों AsiaII 1 और मध्य पूर्व एशिया माइनर 1 (MEAM1) के बीच तंबाकू घुंघराले शूट वायरस (TbCSV) संचारित करने की क्षमता में अंतर वायरस के कारण एशियाII1 की मिडगट दीवार को कुशलतापूर्वक पार करने में सक्षम था लेकिन MEAM18नहीं । इसी तरह, जबकि भूमध्य (मेड) whiteflies आसानी से TYLCV संचारित कर सकते हैं, वे टमाटर पीले पत्ते कर्ल चीन वायरस (TYLCCNV) संचारित करने में विफल । पीएसजी में वायरस का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन का उपयोग करके चयनात्मक संचरण की जांच की गई थी, जिससे पता चला कि TYLCCNV आसानी से मेड व्हाइटफ्लियों26के पीएसजी को पार नहीं करता है । टायलसीवी सीपी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहस्थानीयकरण और व्हाइटफ्लाई मिडगुट्स में ऑटोफैगी मार्कर प्रोटीन एटीजी 8-II से पता चलता है कि ऑटोफैगी व्हाइटफ्लाई27में टायलसीवी के संक्रमण का दमन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
यहां, एक उदाहरण के रूप में TYLCV का उपयोग करते हुए, हम एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक द्वारा व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी और अंडाशय में बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तकनीक में प्राथमिक और रंग-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ विच्छेदन, निर्धारण और ऊष्मायन शामिल है। व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरल प्रोटीन के स्थान को दिखाने वाले फ्लोरेसेंस संकेतों को फिर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग बेगोमोवायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जा सकता है। हम व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी, हीमोलिम्फ और अंडाशय में एसआईबीआर ग्रीन-आधारित क्यूपीसीआर का उपयोग करके TYLCV के क्वांटिफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग विभिन्न व्हाइटफ्लाई ऊतक नमूनों में वायरस की मात्रा की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम प्रतिकार और क्यूपीसीआर द्वारा अपने व्हाइटफ्लाई वेक्टर के ऊतकों में एक बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण और मात्राकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विच्छेदन व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस को ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या: 2017YFD0200600), चीन कृषि अनुसंधान प्रणाली के लिए निर्धारित निधि (अनुदान संख्या: कारों-23-D07) और बिल & मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (निवेश आईडी OPP1149777द्वारा समर्थित था ). हम TYLCV सीपी एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए प्रो जियान-जियांग वू को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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