Lokalisering og kvantifisering av begomovirus i whitefly vev av immunofluorescens og kvantitativ pcr
Summary
Vi beskriver en immunofluorescens og kvantitativ PCR-metode for lokalisering og kvantifisering av begomovirus i insektvev. Immunofluorescensprotokollen kan brukes til å samlokalisere virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokollen kan utvides til å kvantifisere virus i hele whitefly-legemer og virusinfiserte planter.
Abstract
Begomovirus (slekten Begomovirus, familie Geminiviridae) overføres av hvite fluer i Bemisia tabaci-komplekset på en vedvarende, sirkulasjonsmåte. Tatt i betraktning den omfattende skaden forårsaket av begomovirus for å beskjære produksjonen over hele verden, er det viktig å forstå samspillet mellom begomovirus og deres whitefly vektor. For å gjøre dette, lokalisering og kvantifisering av viruset i vektorvev er avgjørende. Her, ved hjelp av tomat gul blad curl virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljert protokoll for å lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spyttkjertler, og eggstokkene ved immunofluorescens. Metoden er basert på bruk av spesifikke antistoffer mot et viruspelsprotein, dye-merket sekundære antistoffer og et konfokal mikroskop. Protokollen kan også brukes til å kolokalisere begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver videre en protokoll for kvantifisering av TYLCV i whitefly midguts, primære spyttkjertler, hemolymph, og eggstokkene av kvantitative PCR (qPCR). Ved hjelp av primere som er spesielt utviklet for TYLCV, tillater protokollene for kvantifisering sammenligning av mengden TYLCV i forskjellige vev av whitefly. Den beskrevne protokollen er potensielt nyttig for kvantifisering av begomovirus i kroppen til en whitefly og en virusinfisert plante. Disse protokollene kan brukes til å analysere sirkulasjonsveien til begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder for å studere whitefly-begomovirus interaksjoner.
Introduction
I de siste tiårene har begomovirus (slektbegomovirus, familie Geminiviridae) forårsaket alvorlig skade på produksjonen av mange grønnsaker, fiber og dekorative avlinger over hele verden1. Begomovirus overføres på en vedvarende måte av whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art som inneholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og atferd, for eksempel fecundity4, lang levetid4,og vert preferanse5,6. Videre varierer overføringseffektiviteten til en gitt begomovirusart /stamme for forskjellige whitefly kryptiske arter selv under de samme eksperimentelle forholdene7,8,9,10, noe som indikerer at det er en kompleks interaksjon mellom begomovirus og whiteflies. For bedre å forstå mekanismene underliggende whitefly-begomovirus interaksjoner, lokalisering og kvantifisering av viruset i whitefly vev er avgjørende.
Tomat gul blad curl virus (TYLCV) er et begomovirus som først ble rapportert i Israel, men i dag forårsaker alvorlig skade på tomatproduksjon over hele verden11,12. På grunn av sin økonomiske betydning, er det en av de best studerte begomovirus13. Som andre monopartite begomovirus er TYLCV et sirkulært DNA-virus med én tråd med en genomstørrelse på ca. 2800 nukleotider14. Mens fortsatt under debatt, flere linjer med bevis støtte replikering av TYLCV i whiteflies15,16,17. Videre har samspillet mellom TYLCV-partikler og whitefly proteiner blitt rapportert6,18,19,20. For virusoverføring får whiteflies TYLCV ved å mate på virusinfiserte planter, virions passerer langs matkanalen for å nå spiserøret, trenge inn i midgutveggen for å nå hemolymfen, og deretter translocate inn i de primære spyttkjertlene (PSGs). Til slutt er virions egested med spytt langs spyttkanalen i plantephloem21. Videre viser flere studier at TYLCV er i stand til å overføres transovarialt fra kvinnelige hvitefluer til deres avkom22,23. Med andre ord, for å oppnå produktiv overføring, må viruset overvinne cellulære barrierer i whitefly for å translocate fra ett vev til et annet. Under kryssingen av disse barrierene vil interaksjoner mellom whitefly og virusproteiner sannsynligvis forekomme, noe som sannsynligvis bestemmer effektiviteten som virusene overføres med.
Immunofluorescens er en vanlig teknikk for proteinfordelingsanalyse. Spesifisiteten av antistoffer som binder seg til antigenet danner grunnlaget for immunofluorescens. På grunn av den økonomiske betydningen av TYLCV, monoklonale antistoffer mot TYLCV pels protein er utviklet, og tilbyr en svært følsom måte å lokalisere viruset24. Kvantitativ PCR (qPCR) tillater følsom og spesifikk kvantifisering av nukleinsyrer. Denne teknikken er oftest basert på bruk av hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende dye (f.eks. SYBR Green) deteksjon. For hydrolyserprobebasert qPCR er det nødvendig med spesifikke sonder, noe som øker kostnadene. Fluorescerende fargebasert qPCR er enklere og mer kostnadseffektiv, fordi merket amplicon-spesifikke hybridiseringsprober ikke er nødvendig25. Så langt har flere studier brukt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder for å undersøke de komplekse begomovirus-whitefly interaksjoner. For eksempel, Pan et al. utført qPCR og immunofluorescens analyse av viruset i whitefly vev og fant at forskjellen i evne til å overføre tobakk krøllete skyte virus (TbCSV) mellom whitefly arter AsiaII 1 og Midtøsten Asia Minor 1 (MEAM1) var på grunn av viruset å effektivt krysse midgut veggen av AsiaII1, men ikke MEAM18. På samme måte, mens middelhavshvitfluer (MED) lett kan overføre TYLCV, klarer de ikke å overføre tomatgul bladkrøll Kina-virus (TYLCCNV). Selektiv overføring ble undersøkt ved hjelp av immunofluorescens deteksjon av virus i PSGs, som viste at TYLCCNV ikke lett krysser PSGs av MED whiteflies26. Immunofluorescence kolokalisering av TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser at autofagi spiller en kritisk rolle i å undertrykke infeksjonen av TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjelp av TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokoll for lokalisering av begomovirus i whitefly midguts, PSGs og eggstokkene ved en immunofluorescensteknikk. Teknikken inkluderer disseksjon, fiksering og inkubasjon med primære og farsmerkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler som viser plasseringen av virusproteiner i whitefly-vevet kan deretter oppdages under et konfokalmikroskop. Enda viktigere, denne protokollen kan brukes til å kolocalisere begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver videre en protokoll for kvantifisering av TYLCV ved hjelp av SYBR Green-baserte qPCR i whitefly midguts, PSGs, hemolymph og eggstokkene, som kan brukes til å sammenligne mengden virus i forskjellige whitefly vevsprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for lokalisering og kvantifisering av et begomovirus i vevet på whitefly-vektoren ved immunofluorescens og qPCR. Disseksjon representerer det første trinnet for å lokalisere og kvantifisere viruset i whitefly vev. Whitefly kroppen er ca 1 mm i lengde, noe som betyr at vevet er ekstremt små, og det er vanskelig å dissekere dem. Dessuten er det sterke forbindelser mellom vevet. For eksempel er eggstokkene tett forbundet med bakteriocytter, noe som gjør dem vanskelige å isolere. Her, med…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), det øremerkede fondet for China Agriculture Research System (stipendnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for å gi TYLCV CP antistoffer.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
