Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa
Summary
Describimos un método de inmunofluorescencia y PCR cuantitativo para la localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de insectos. El protocolo de inmunofluorescencia se puede utilizar para colocalizar proteínas virales y vectoriales. El protocolo cuantitativo de PCR puede ampliarse para cuantificar los virus en cuerpos enteros de moscas blancas y plantas infectadas por virus.
Abstract
Los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)son transmitidos por las moscas blancas del complejo Bemisia tabaci de una manera persistente y circulativa. Teniendo en cuenta los extensos daños causados por los begomovirus a la producción de cultivos en todo el mundo, es imperativo entender la interacción entre los begomovirus y su vector de mosca blanca. Para ello, la localización y cuantificación del virus en los tejidos vectoriales es crucial. Aquí, utilizando el virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) como ejemplo, describimos un protocolo detallado para localizar begomovirus en las moscas blancas, glándulas salivales primarias y ovarios por inmunofluorescencia. El método se basa en el uso de anticuerpos específicos contra una proteína de capa de virus, anticuerpos secundarios etiquetados con tinte y un microscopio confocal. El protocolo también se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV en las moscas blancas, las glándulas salivales primarias, la hemolinfa y los ovarios por PCR cuantitativo (qPCR). Utilizando imprimaciones diseñadas específicamente para TYLCV, los protocolos para la cuantificación permiten la comparación de la cantidad de TYLCV en diferentes tejidos de la mosca blanca. El protocolo descrito es potencialmente útil para la cuantificación de begomovirus en el cuerpo de una mosca blanca y una planta infectada por el virus. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar la vía de circulación de begomovirus en la mosca blanca o como complemento a otros métodos para estudiar las interacciones entre mosca blanca y begomovirus.
Introduction
En las últimas décadas, los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)han causado graves daños a la producción de muchos cultivos vegetales, de fibra y ornamentales en todo el mundo1. Los begomovirus son transmitidos de manera persistente por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que es una especie compleja que contiene más de 35 especies crípticas2,3. Los begomovirus pueden afectar directa o indirectamente a la fisiología y el comportamiento de las moscas blancas, como la fecundidad4,la longevidad4y la preferencia del huésped5,6. Además, la eficiencia de transmisión de una especie/cepa de begomovirus determinada varía para diferentes especies crípticas de mosca blanca incluso en las mismas condiciones experimentales7,8,9,10, lo que indica que hay una interacción compleja entre begomovirus y moscas blancas. Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a las interacciones entre mosca blanca y begomovirus, la localización y cuantificación del virus en los tejidos de mosca blanca son esenciales.
El virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) es un begomovirus que se notificó por primera vez en Israel pero que hoy en día causa graves daños a la producción de tomate en todo el mundo11,12. Debido a su importancia económica, es uno de los begomovirus13mejor estudiados. Al igual que otros begomovirus monopartitos, TYLCV es un virus de ADN circular de una sola cadena con un tamaño de genoma de aproximadamente 2.800 nucleótidos14. Mientras todavía está en debate, varias líneas de evidencia apoyan la replicación de TYLCV en las moscas blancas15,16,17. Además, se ha notificado la interacción de partículas TYLCV y proteínas de mosca blanca6,18,19,20. Para la transmisión del virus, las moscas blancas adquieren TYLCV alimentándose de plantas infectadas por virus, los viriones pasan a lo largo del canal de alimentos para llegar al esófago, penetran en la pared del intestino medio para llegar a la hemolinfa y luego se translocan en las glándulas salivales primarias (PSG). Finalmente, los viriones se egasíd con saliva a lo largo del conducto salival en el phloem vegetal21. Además, varios estudios muestran que TYLCV es capaz de ser transmitido transovarialmente de las moscas blancas hembras a su descendencia22,23. En otras palabras, para lograr una transmisión productiva, el virus tiene que superar las barreras celulares dentro de la mosca blanca para transubicarse de un tejido a otro. Durante el cruce de estas barreras, es probable que se produzcan interacciones entre las moscas blancas y las proteínas del virus, probablemente determinando la eficiencia con la que se transmiten los virus.
La inmunofluorescencia es una técnica comúnmente utilizada para el análisis de distribución de proteínas. La especificidad de los anticuerpos que se unen a su antígeno forman la base de la inmunofluorescencia. Debido a la importancia económica de TYLCV, se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra la proteína de recubrimiento TYLCV, ofreciendo una forma altamente sensible de localizar el virus24. El PCR cuantitativo (qPCR) permite la cuantificación sensible y específica de los ácidos nucleicos. Esta técnica se basa con mayor frecuencia en el uso de sonda de hidrólisis (por ejemplo, TaqMan) o detección de tinte fluorescente (por ejemplo, SYBR Green). Para el qPCR basado en sondas de hidrólisis, se necesitan sondas específicas, lo que en consecuencia aumenta el costo. El qPCR basado en tintes fluorescentes es más simple y rentable, ya que las sondas de hibridación específicas del amplificador etiquetadas no son necesarias25. Hasta ahora, varios estudios han utilizado inmunofluorescencia y qPCR junto con otros métodos para investigar las complejas interacciones begomovirus-mosca blanca. Por ejemplo, Pan et al. realizaron un análisis qPCR e inmunofluorescencia del virus en tejidos de mosca blanca y encontraron que la diferencia en la capacidad de transmitir el virus del brote rizado de tabaco (TbCSV) entre las especies de moscas blancas AsiaII 1 y Asia Medio Menor 1 (MEAM1) se debía a que el virus era capaz de cruzar eficientemente la pared intermedia de AsiaII1 pero no MEAM18. Del mismo modo, mientras que las moscas blancas mediterráneas (MED) pueden transmitir fácilmente TYLCV, no transmiten el virus de China curva de hoja amarilla de tomate (TYLCCNV). La transmisión selectiva se investigó utilizando la detección de inmunofluorescencia de virus en los PSG, lo que demostró que TYLCCNV no cruza fácilmente los PSG de las moscas blancas MED26. La colocalización de inmunofluorescencia de TYLCV CP y la proteína marcadora de autofagia ATG8-II en las moscas blancas muestran que la autofagia desempeña un papel crítico en la represión de la infección de TYLCV en la mosca blanca27.
Aquí, utilizando TYLCV como ejemplo, describimos un protocolo para la localización de begomovirus en las moscas blancas, PSG y ovarios mediante una técnica de inmunofluorescencia. La técnica incluye disección, fijación e incubación con anticuerpos secundarios primarios y etiquetados con tinte. Las señales de fluorescencia que muestran la ubicación de las proteínas virales en los tejidos de las moscas blancas se pueden detectar bajo un microscopio confocal. Más importante aún, este protocolo se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV utilizando qPCR basado en SYBR Green en los intestinos medios de mosca blanca, PSG, hemolinfa y ovarios, que se puede utilizar para comparar la cantidad de virus en diferentes muestras de tejido de mosca blanca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un protocolo para la localización y cuantificación de un begomovirus en los tejidos de su vector de mosca blanca por inmunofluorescencia y qPCR. La disección representa el primer paso para localizar y cuantificar el virus en los tejidos de mosca blanca. El cuerpo de la mosca blanca es de aproximadamente 1 mm de longitud, lo que significa que los tejidos son extremadamente pequeños, y es difícil diseccionarlos. Además, hay fuertes conexiones entre los tejidos. Por ejemplo, los ovarios están estrec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (Número de subvención: 2017YFD0200600), el fondo destinado al Sistema de Investigación Agrícola de China (número de subvención: CARS-23-D07) y la Fundación Bill & Melinda Gates (Investment ID OPP11497777 ). Agradecemos al Profesor Jian-Xiang Wu por proporcionar anticuerpos TYLCV CP.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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