Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR
Summary
Wir beschreiben eine Immunfluoreszenz und quantitative PCR-Methode zur Lokalisierung und Quantifizierung von Begomoviren in Insektengeweben. Das Immunfluoreszenzprotokoll kann zur Kolokalisierung viraler und vektorieller Proteine verwendet werden. Das quantitative PCR-Protokoll kann erweitert werden, um Viren in ganzen Weißfliegenkörpern und virusinfizierten Pflanzen zu quantifizieren.
Abstract
Begomoviren (Gattung Begomovirus, Geminiviridae)werden von Weißfliegen des Bemisia Tabaci-Komplexes in einer anhaltenden, zirkulierenden Weise übertragen. Angesichts der umfangreichen Schäden, die begomoviren weltweit durch Begomoviren verursacht werden, ist es unerlässlich, die Wechselwirkung zwischen Begomoviren und ihrem Whitefly-Vektor zu verstehen. Dazu ist die Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in den Vektorgeweben von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir am Beispiel des Tomaten-Gelbblattcurlvirus (TYLCV) ein detailliertes Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen und Eierstöcken durch Immunfluoreszenz. Die Methode basiert auf der Verwendung spezifischer Antikörper gegen ein Virusbeschichtungsprotein, mit Farbstoff gekennzeichnete Sekundärantikörper und ein konfokales Mikroskop. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen, Hämolymphen und Eierstöcken nach quantitativer PCR (qPCR). Mit Primern, die speziell für TYLCV entwickelt wurden, ermöglichen die Protokolle zur Quantifizierung den Vergleich der TYLCV-Menge in verschiedenen Geweben der Weißfliege. Das beschriebene Protokoll ist potenziell nützlich für die Quantifizierung von Begomoviren im Körper einer Weißfliege und einer virusinfizierten Pflanze. Diese Protokolle können verwendet werden, um den Zirkulationsweg von Begomoviren in der Weißfliege zu analysieren oder als Ergänzung zu anderen Methoden zur Untersuchung von Whitefly-Begomovirus-Wechselwirkungen.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten haben Begomoviren (Gattung Begomovirus, Familie Geminiviridae) schwere Schäden an der Produktion von vielen Pflanzlichen, Fasern und Zierpflanzen weltweit verursacht1. Begomoviren werden in beharrlicher Weise durch die Weißfliege Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) übertragen, die eine komplexe Art mit über 35 kryptischen Arten2,3ist. Begomoviren können direkt oder indirekt Diephysiologie und das Verhalten von Weißfliegen beeinflussen, wie z. B. Fruchtbarkeit4, Langlebigkeit4und Wirtspräferenz5,6. Darüber hinaus variiert die Übertragungseffizienz einer bestimmten Begomovirus-Art/Stamm für verschiedene weißfliegende kryptische Arten auch unter den gleichen experimentellen Bedingungen7,8,9,10, was darauf hindeutet, dass es eine komplexe Wechselwirkung zwischen Begomoviren und Weißfliegen gibt. Um die Mechanismen, die den Wechselwirkungen zwischen Whitefly-Begomovirus zugrunde liegen, besser zu verstehen, sind Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben unerlässlich.
Tomatengelbblatt-Curlvirus (TYLCV) ist ein Begomovirus, das zuerst in Israel berichtet wurde, aber heutzutage schwere Schäden an der Tomatenproduktion weltweit verursacht11,12. Aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung ist es eines der am besten untersuchten Begomoviren13. Wie andere monopartitige Begomoviren ist TYLCV ein einsträngiges kreisförmiges DNA-Virus mit einer Genomgröße von etwa 2.800 Nukleotiden14. Während noch diskutiert, mehrere Evidenzlinien unterstützen die Replikation von TYLCV in Weißfliegen15,16,17. Darüber hinaus wurde die Wechselwirkung von TYLCV-Partikeln und Whitefly-Proteinen6,18,19,20berichtet. Für die Virusübertragung erhalten Weißfliegen TYLCV, indem sie sich von virusinfizierten Pflanzen ernähren, Virionen passieren den Nahrungskanal, um die Speiseröhre zu erreichen, dringen in die Mitteldarmwand ein, um die Hämolymphe zu erreichen, und transortisieren sich dann in die primären Speicheldrüsen (PSGs). Schließlich werden Virionen mit Speichel entlang des Speichelkanals in Pflanzenphloem21aufgenommen. Darüber hinaus zeigen mehrere Studien, dass TYLCV transovarial von weiblichen Weißfliegen auf ihre Nachkommen übertragen werden kann22,23. Mit anderen Worten, um eine produktive Übertragung zu erreichen, muss das Virus zelluläre Barrieren innerhalb der Weißfliege überwinden, um sich von einem Gewebe zum anderen zu verlagern. Während des Überschreitens dieser Barrieren sind Wechselwirkungen zwischen Whitefly- und Virusproteinen wahrscheinlich, was wahrscheinlich die Effizienz bestimmt, mit der die Viren übertragen werden.
Immunfluoreszenz ist eine häufig verwendete Technik für die Proteinverteilungsanalyse. Die Spezifität von Antikörpern, die an ihr Antigen binden, bilden die Grundlage der Immunfluoreszenz. Aufgrund der wirtschaftlichen Bedeutung von TYLCV wurden monoklonale Antikörper gegen das TYLCV-Beschichtungsprotein entwickelt, die eine hochempfindliche Möglichkeit bieten, das Virus zu lokalisieren24. Quantitative PCR (qPCR) ermöglicht eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Nukleinsäuren. Diese Technik basiert am häufigsten auf der Verwendung von Hydrolysesonden (z. B. TaqMan) oder Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green) Detektion. Für hydrolysesondenbasierte qPCR werden spezifische Sonden benötigt, die die Kosten erhöhen. Fluoreszierende Farbstoff-basierte qPCR ist einfacher und kostengünstiger, da markierte ampliconspezifische Hybridisierungssonden nicht erforderlich sind25. Bisher wurden in mehreren Studien Immunfluoreszenz und qPCR zusammen mit anderen Methoden zur Untersuchung der komplexen Begomovirus-Whitefly-Wechselwirkungen verwendet. Zum Beispiel führten Pan et al. qPCR und Immunfluoreszenzanalyse des Virus in Weißfliegengeweben durch und fanden heraus, dass der Unterschied in der Fähigkeit, Tabak-Curly-Shoot-Virus (TbCSV) zwischen den Whitefly-Arten AsiaII 1 und Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) zu übertragen, darauf zurückzuführen war, dass das Virus in der Lage war, effizient die Mittelgutwand von AsiaII1, aber nicht MEAM18zu überqueren. In ähnlicher Weise können mediterrane (MED) Weißfliegen tYLCV leicht übertragen, aber sie können das tomatengelbe Blatt Curl China Virus (TYLCCNV) nicht übertragen. Die selektive Übertragung wurde mit Hilfe des Immunfluoreszenznachweises von Viren in den PSGs untersucht, was zeigte, dass TYLCCNV die PSGs von MED Whiteflies26nicht leicht kreuzen. Die Immunfluoreszenzkolokalisierung von TYLCV CP und dem autophagy Marker Protein ATG8-II in Whitefly Midguts zeigt, dass die Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Unterdrückung der Infektion von TYLCV im Whitefly27spielt.
Hier beschreiben wir am Beispiel TYLCV ein Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, PSGs und Eierstöcken durch eine Immunfluoreszenztechnik. Die Technik umfasst Sezieren, Fixieren und Inkubation mit primären und farbstoffmarkierten sekundären Antikörpern. Fluoreszenzsignale, die die Position viraler Proteine im Weißfliegengewebe anzeigen, können dann unter einem konfokalen Mikroskop nachgewiesen werden. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV mit SYBR Green-based qPCR in Whitefly Midguts, PSGs, Hämolymphe und Eierstöcken, das verwendet werden kann, um die Virusmenge in verschiedenen Whitefly-Gewebeproben zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Lokalisierung und Quantifizierung eines Begomovirus in den Geweben seines Whitefly-Vektors durch Immunfluoreszenz und qPCR. Die Dissektion stellt den ersten Schritt zur Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben dar. Der Weißfliegenkörper ist etwa 1 mm lang, was bedeutet, dass die Gewebe extrem klein sind, und es ist schwierig, sie zu sezieren. Außerdem gibt es starke Verbindungen zwischen den Geweben. Zum Beispiel sind die Eierstöcke eng mit den Bakterio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program (Grant-Nummer: 2017YFD0200600), den zweckgebundenen Fonds für das China Agriculture Research System (Zuschussnummer: CARS-23-D07) und die Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Wir danken Prof. Jian-Xiang Wu für die Bereitstellung von TYLCV CP Antikörpern.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
