Vi beskriver en immunfluorescens og kvantitativ PCR-metode til lokalisering og kvantificering af begomovirus i insektvæv. Immunofluorescensprotokollen kan bruges til at colocalize virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokol kan udvides til at kvantificere virus i hele whitefly organer og virus-inficerede planter.
Begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)overføres af whiteflies af Bemisia tabaci kompleks i en vedvarende, cirkulerende måde. I betragtning af de omfattende skader forårsaget af begomovirus til afgrødeproduktion på verdensplan, er det bydende nødvendigt at forstå samspillet mellem begomovirus og deres whitefly vektor. For at gøre dette, lokalisering og kvantificering af virus i vektorvæv er afgørende. Her, ved hjælp af tomat gul blad krølle virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljeret protokol til at lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spytkirtler, og æggestokke ved immunfluorescens. Metoden er baseret på brugen af specifikke antistoffer mod et viruscoatprotein, farvemærkede sekundære antistoffer og et konfokalmikroskop. Protokollen kan også bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV i whitefly midguts, primære spytkirtler, hæmolymfe og æggestokke efter kvantitativ PCR (qPCR). Ved hjælp af primere specielt designet til TYLCV, protokollerne til kvantificering tillader sammenligning af mængden af TYLCV i forskellige væv af whitefly. Den beskrevne protokol er potentielt nyttig til kvantificering af begomovirus i kroppen af en whitefly og en virus-inficeret plante. Disse protokoller kan bruges til at analysere cirkulation stil en begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder til at studere whitefly-begomovirus interaktioner.
I de sidste årtier, begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)har forårsaget alvorlige skader på produktionen af mange vegetabilske, fiber, og prydafgrøder på verdensplan1. Begomovirus overføres på en vedvarende måde af whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art, der indeholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og adfærd, såsom frugtbarhed4,levetid4,og vært præference5,6. Desuden varierer transmissionseffektiviteten af en given begomovirusart/stamme for forskellige hvidflyvekryptiske arter, selv under de samme forsøgsbetingelser7,8,9,10, hvilket indikerer, at der er et komplekst samspil mellem begomovirus og hvidfluer. For bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering og kvantificering af virus i whitefly væv er afgørende.
Tomat gul blad krølle virus (TYLCV) er en begomovirus, der først blev rapporteret i Israel, men i dag forårsager alvorlige skader på tomat produktion på verdensplan11,12. På grund af sin økonomiske betydning, det er en af de bedst undersøgte begomovirus13. Ligesom andre monopartit begomovirus er TYLCV en cirkulær DNA-virus med en enkeltstrengs cirkulær DNA-virus med en genomstørrelse på ca. 2.800 nukleotider14. Mens der stadig er under debat, flere linjer af beviser understøtter replikering af TYLCV i whiteflies15,16,17. Desuden er samspillet mellem TYLCV-partikler og whiteflyproteiner rapporteret6,18,19,20. For virus transmission, whiteflies erhverve TYLCV ved fodring på virus-inficerede planter, virioner passere langs fødevarekanalen for at nå spiserøret, trænge ind i midgut væggen for at nå hæmolymfen, og derefter flytte ind i den primære spytkirtler (PSGs). Endelig er virioner egested med spyt langs spytkanalen i plantphloem21. Endvidere viser flere undersøgelser, at TYLCV er i stand til at overføres fra kvindelige hvidefluer til deres afkom22,23. Med andre ord, for at opnå produktiv transmission, virus har til at overvinde cellulære barrierer i whitefly at flytte fra et væv til et andet. Under passagen af disse barrierer, interaktioner mellem whitefly og virus proteiner vil sandsynligvis forekomme, sandsynligvis bestemme den effektivitet, hvormed virus overføres.
Immunfluorescens er en almindeligt anvendt teknik til proteinfordelingsanalyse. Specificiteten af antistoffer, der er bindende for deres antigen, danner grundlag for immunfluorescens. På grund af den økonomiske betydning af TYLCV, monoklonale antistoffer mod TYLCV pels protein er blevet udviklet, tilbyder en meget følsom måde at lokalisere virus24. Kvantitativ PCR (qPCR) muliggør følsom og specifik kvantificering af nukleinsyrer. Denne teknik er oftest baseret på anvendelse af hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende farvestof (f.eks. For hydrolyse sonde-baserede qPCR, er der behov for specifikke sonder, hvilket derfor øger omkostningerne. Fluorescerende farvestof-baserede qPCR er enklere og mere omkostningseffektiv, fordi mærket amplicon-specifikke hybridisering sonder ikke er påkrævet25. Hidtil, flere undersøgelser har brugt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder til at undersøge de komplekse begomovirus-whitefly interaktioner. For eksempel udførte Pan et al. qPCR og immunfluorescensanalyse af virus i whiteflyvæv og fandt, at forskellen i evnen til at overføre tobak krøllet skyde virus (TbCSV) mellem whitefly arter AsiaII 1 og Mellemøsten Asien Minor 1 (MEAM1) skyldtes virus er i stand til effektivt at krydse midgut væggen i AsiaII1, men ikke MEAM18. Tilsvarende, mens Middelhavet (MED) whiteflies let kan overføre TYLCV, de undlader at overføre tomat gul blad krølle Kina virus (TYLCCNV). Selektiv overførsel blev undersøgt ved hjælp af immunfluorescenspåvisning af virus i PSG’erne, som viste, at TYLCCNV ikke let krydser PSG’erne i MED whiteflies26. Immunfluorescens colokalisering af TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser, at autofagi spiller en afgørende rolle i at undertrykke infektionen af TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjælp af TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokol for lokalisering af begomovirus i whitefly midguts, PSGs, og æggestokke ved en immunfluorescens teknik. Teknikken omfatter dissektion, fiksering og inkubation med primære og farvemærkemærkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler, der viser placeringen af virale proteiner i whitefly-vævene, kan derefter påvises under et konfokalmikroskop. Endnu vigtigere, denne protokol kan bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV ved hjælp af SYBR Green-baserede qPCR i whitefly midguts, PSGs, hæmolymfe og æggestokke, der kan bruges til at sammenligne mængden af virus i forskellige whitefly vævsprøver.
Her beskriver vi en protokol for lokalisering og kvantificering af en begomovirus i væv af sin whitefly vektor ved immunfluorescens og qPCR. Dissektion repræsenterer det første skridt til at lokalisere og kvantificere virus i whitefly væv. Den whitefly krop er omkring 1 mm i længden, hvilket betyder, at væv er ekstremt små, og det er svært at dissekere dem. Desuden er der stærke forbindelser mellem væv. For eksempel er æggestokkene tæt forbundet med bakteriokytter, hvilket gør dem vanskelige at isolere. Her …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), den øremærkede fond for China Agriculture Research System (tilskudsnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for at give TYLCV CP antistoffer.
4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |