JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Published: January 14, 2020
doi:
10.3791/60738
, , , ,
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design,University of Washington

Summary

Создание химически индуцированных систем димеризации белка с желаемой близостью и специфичностью для любой небольшой молекулы лиганд будет иметь много биологических приложений зондирования и активации. Здесь мы описываем эффективный, обобщенный метод де Ново-инженерии химически индуцированных систем димеризации через пошаговый выбор фаговычной библиотеки антител, отображаемой фагой.

Abstract

События димеризации белка, происходящие только в присутствии маломолекулярного лигана, позволяют развивать маломолекулярные биосенсоры для вскрытия и манипуляции биологическими путями. В настоящее время существует лишь ограниченное число химически индуцированных систем димеризации (CID), и проектирование новых с желаемой чувствительностью и избирательностью для конкретных малых молекуловых лигандов остается проблемой в области белковой инженерии. Мы здесь описываем метод скрининга высокой пропускной записи, комбинаториальный биндерс-e nabled sизбрание CID (COMBINES-CID), для de novo инженерных систем CID, применимых к большому разнообразию лигандов. Этот метод использует двухступенчатый выбор фаговычных комбинаторных нано-библиотеки для получения 1) “якорных связующих”, которые сначала связываются с лигандой интереса, а затем 2) “димеризации связующих”, которые связывают только якорь связующего-лигандкомплексов. Для выбора якорных связующих, комбинаторная библиотека более 109 комплементарно-определяющих области (CDR)-рандомизированные нанотела проверяются с помощью биотиниляции лиганда и хиты проверяются с немаркированной лигандостью биослойной интерферометрией (BLI). Для получения димеризации связующих, наникто библиотека проверяется с якорным связующего-лиганд комплексов в качестве мишеней для положительного скрининга и несвязанных связующих якорных связующих для отрицательного скрининга. COMBINES-CID широко применима к выбору связующих CID с другими иммуноглобулином, неиммуноглобулином или вычислительно разработанными эшафотами для создания биосенсоров для in vitro и in vivo обнаружения лекарств, метаболитов, сигнальных молекул и т.д.

Introduction

СИСТЕМы CID, в которых два белка димеризируются только в присутствии маломолекулярного лиганда(рисунок 1), предлагают универсальные инструменты для вскрытия и манипулирования метаболическими, сигнальными и другими биологическими путями1. Они продемонстрировали потенциал в биологической активации, таких как контролируемые препаратами Т-клеточной активации2 и апоптоз3,4, для повышения безопасности и эффективности приемной Т-клеточной терапии. Кроме того, они обеспечивают новую методологию для in vivo или in vitro обнаружения малых молекул. Например, белки CID могут быть генетически слиты с системами репортера флуоресценции (например, флуоресцентный резонанс передачи энергии (FRET)5 и круговой перемутированный флуоресцентные белки)6 для измерения в режиме реального времени в виво, или служить в качестве сродства реагентов для сэндвич фермент-связанных иммуносорбентовых анализов (ELISA) – как анализы.

Несмотря на их широкое применение, создание новых систем CID, которые могут управляться данной маломолекулярной лигандой, имеет серьезные проблемы. Установленные методы инженерного связующего белка, включая иммунизацию животных7,выбор в пробирке8,9,и вычислительный дизайн белка10 может генерировать лиганд связывающие белки, которые функционируют через бинарные взаимодействия белка-лигада. Тем не менее, эти методы имеют трудности создания лиганд-индуцированной ternary CID комплекса. Некоторые методы создают CID путем химически соединяя 2 ligands которые независимо связывают к таким же или по-разному протеитам11,12,13,14,15,16или полагаются на выбирать протеины связующего, such as антитела пристрелящие preexisting малые комплексы молекул-протеина17,18, и таким образом имеют лимитированный выбор ligands.

Недавно мы разработали комбинаториальный биндерс-e nabled сизбранием CID (COMBINES-CID) метод для де Ново инженерных систем CID19. Этот метод может получить высокую специфичность лиганд-индуцированной димеризации (например, якорь-димеризации связующего диссоциации постоянной, KD (без лиганда)/KD (с лигандой) Специфика димеризации достигается с помощью якорных связующих с гибкими связывающими участками, которые могут вводить конформационные изменения при связывании лиганда, обеспечивая основу для выбора конформистски селективных связующих только распознавающих связующие якорные связующие, связанные с лигандой. Мы продемонстрировали доказательство принципа, создавая каннабидиол (CBD) индуцированных гетеродидеров нанотел, 12-15 kDa функциональный фрагмент антитела из верескации, состоящий из универсальной эшафот и три гибких CDR петли (Рисунок 2)20, который может сформировать связывающий карман с адаптируемыми размерами для малых молекул эпитопов21. Примечательно, что выбор в пробирке библиотеки комбинаторного белка должен быть экономически эффективным и обобщенным для инженерии CID, поскольку один и тот же высококачественный библиотечный может быть применен к различным лиганам.

В этом протоколе и видео, мы сосредоточены на описании двухступенчатой в пробирке выбор и проверка якоря(Рисунок 3A) и димеризации связующих(Рисунок 3B) путем скрининга комбинаторных наивных библиотек с разнообразием выше 109 использованием КБР в качестве мишени, но протокол должен быть применим к другим библиотекам белка или малых молекул цели. Скрининг CID связующих обычно занимает 6-10 недель(рисунок 4).

Protocol

1. Строительство библиотеки Используйте синтетические комбинаторные однодоменных антител библиотеки с разнообразием 1,23-7,14 х 109, как ранее описано19. Хотя этот протокол не включает в себя строительство библиотеки, он может быть применен к другим комбинированных ?…

Representative Results

Мы описываем двухэтапный выбор in vitro и проверку якорных и димеризированных связующих путем скрининга комбинаторной библиотеки наноя с разнообразием выше 109 с использованием КБР в качестве мишени. Важное значение имеет оценка обогащения фагового биопанирования во время последов…

Discussion

Очень важно выбрать правильные концентрации входных фаговых библиотек для различных раундов биопанирования. Как правило, мы начинали с входной библиотеки в 1012-1013 фаговых частиц с разнообразием no109, что позволяет 100-1000 копий каждого фагового клона, которые будут предст…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Университетом Вашингтона Инновационная премия (Л.Г.), грант от Национальных институтов здравоохранения США (1R35GM128918 в L.G.), и стартап-фонд Университета Вашингтона (в L.G.). H.J. была поддержана стипендией Вашингтонского исследовательского фонда. KW была поддержана стипендией бакалавриата из Вашингтонского университета Института белкового дизайна.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Tags

Keywords: Protein DimerizationBiosensorPhage DisplaySingle-domain AntibodySmall MoleculeCell BehaviorCell Metabolite MonitoringStreptavidin BeadsBiotinylated LigandNegative And Positive Selection
check_url/it/60738?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image