Herstellung von Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays für In Vivo Neural Recording

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode zur Herstellung von Ti₃C₂ MXene Mikroelektroden-Arrays und deren Verwendung für die in vivo-neurale Aufnahme.

Abstract

Implantierbare Mikroelektrodentechnologien wurden weit verbreitet eingesetzt, um die neuronale Dynamik auf der Mikroskala aufzuklären, um ein tieferes Verständnis der neuronalen Grundlagen von Hirnerkrankungen und Verletzungen zu gewinnen. Da Elektroden auf die Skala einzelner Zellen miniaturisiert werden, begrenzt ein entsprechender Anstieg der Grenzflächenimpedanz die Qualität der aufgezeichneten Signale. Darüber hinaus sind herkömmliche Elektrodenmaterialien steif, was zu einer signifikanten mechanischen Diskrepanz zwischen der Elektrode und dem umgebenden Hirngewebe führt, was eine Entzündungsreaktion hervorruft, die schließlich zu einer Verschlechterung der Geräteleistung führt. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein Verfahren zur Herstellung flexibler Mikroelektroden auf Basis von Ti₃C₂ MXene entwickelt, einem kürzlich entdeckten Nanomaterial, das eine bemerkenswert hohe volumetrische Kapazität, elektrische Leitfähigkeit, Oberflächenfunktionalität und Verarbeitbarkeit in wässrigen Dispersionen besitzt. Flexible Arrays von Ti₃C₂ MXene Mikroelektroden haben aufgrund der hohen Leitfähigkeit und der hohen spezifischen Oberfläche der Ti₃C₂ MXene-Folien eine bemerkenswert geringe Impedanz und haben sich als exquisit empfindlich für die Aufzeichnung neuronaler Aktivität erwiesen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige Methode zum Mikromustern von Ti_3C2 MXen e in Mikroelektroden-Arrays auf flexiblen polymeren Substraten und skizzieren deren Verwendung für die In-vivo-Mikroelektrokortikographie-Aufzeichnung. Diese Methode kann leicht erweitert werden, um MXene-Elektroden-Arrays beliebiger Größe oder Geometrie für eine Reihe anderer Anwendungen in der Bioelektronik zu erstellen und es kann auch für den Einsatz mit anderen leitfähigen Tinten neben Ti₃C₂ MXen angepasst werden. Dieses Protokoll ermöglicht die einfache und skalierbare Herstellung von Mikroelektroden aus lösungsbasierten leitfähigen Tinten und ermöglicht es speziell, die einzigartigen Eigenschaften von hydrophilen Ti₃C₂ MXene zu nutzen, um viele der Barrieren zu überwinden, die die weit verbreitete Verbreitung von kohlenstoffbasierten Nanomaterialien für hochtreue neuronale Mikroelektroden lange behindert haben.

Introduction

Das Verständnis der grundlegenden Mechanismen, die neuronalen Schaltkreisen zugrunde liegen, und wie ihre Dynamik bei Krankheiten oder Verletzungen verändert wird, ist ein entscheidendes Ziel für die Entwicklung wirksamer Therapeutika für eine breite Palette von neurologischen und neuromuskulären Erkrankungen. Mikroelektrodentechnologien wurden häufig eingesetzt, um die neuronale Dynamik auf feinen räumlichen und zeitlichen Skalen aufzuklären. Die Aufnahme stabiler Aufnahmen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) von Mikroelektroden hat sich jedoch als besonders anspruchsvoll erwiesen. Da die Abmessungen der Elektroden auf eine zelluläre Skala reduziert werden, verschlechtert ein entsprechender Anstieg der Elektrodenimpedanz die Signalqualität¹. Darüber hinaus haben zahlreiche Studien gezeigt, dass starre Elektroden aus herkömmlichen Silizium- und Metallelektronikmaterialien erhebliche Schäden und Entzündungen im Nervengewebe verursachen, was ihre Nützlichkeit für die Langzeitaufzeichnung^2,3,4,5begrenzt. Angesichts dieser Fakten besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Mikroelektroden mit neuen Materialien, die die Impedanz der Elektroden-Gewebe-Schnittstelle reduzieren und in weiche und flexible Formfaktoren einfließen lassen können.

Eine häufig verwendete Methode zur Reduzierung der Elektroden-Gewebe-Grenzianz-Impedanz ist die Erhöhung des Bereichs, über den ionische Arten in der extrazellulären Flüssigkeit mit der Elektrode oder der “effektiven Oberfläche” der Elektrode interagieren können. Dies kann durch Nanomusterung⁶, Oberflächenaufrauung⁷oder Galvanik mit porösen Additiven^8,9erreicht werden. Nanomaterialien haben in diesem Bereich große Aufmerksamkeit gewonnen, weil sie an sich hohe spezifische Oberflächen und einzigartige Kombinationen von günstigen elektrischen und mechanischen Eigenschaften bieten¹⁰. Zum Beispiel wurden Kohlenstoff-Nanoröhren als Beschichtung verwendet, um die Elektrodenimpedanz deutlich zu reduzieren^11,12,13, Graphenoxid wurde zu weichen, flexiblen freistehenden Sondenelektroden¹⁴verarbeitet, und laserpyrolysiertes poröses Graphen wurde für flexible, niedrig impedante Mikroelektrokortikographie (Mikro-ECoG)-Elektroden¹⁵verwendet. Trotz ihres Versprechens hat der Mangel an skalierbaren Montagemethoden die weit verbreitete Verbreitung von Nanomaterialien für neuronale Verbindungselektroden eingeschränkt. Insbesondere kohlenstoffbasierte Nanomaterialien sind typischerweise hydrophob und erfordern daher die Verwendung von Tensiden¹⁶, Supersäuren¹⁷oder Oberflächenfunktionalisierung^18, um wässrige Dispersionen für lösungsverarbeitende Herstellungsverfahren zu bilden, während alternative Herstellungsverfahren wie chemische Dampfabscheidung (CVD) in der Regel hohe Temperaturen erfordern, die mit vielen polymeren Substraten unvereinbar sind^{19,20,21 ,22}.

Kürzlich wurde eine Klasse von zweidimensionalen (2D) Nanomaterialien, bekannt als MXenes, beschrieben, die eine außergewöhnliche Kombination aus hoher Leitfähigkeit, Flexibilität, volumetrischer Kapazität und inhärenter Hydrophilität bietet, was sie zu einer vielversprechenden Klasse von Nanomaterialien für neuronale Schnittstellenelektroden^{macht 23}. MXenes sind eine Familie von 2D-Übergangsmetallcarbiden und Nitriden, die am häufigsten durch selektives Ätzen des A-Elements aus geschichteten Vorläufern hergestellt werden. Dies sind in der Regel MAX-Phasen mit der allgemeinen Formel M_n+1AX_n, wobei M ein Frühübergangsmetall ist, A ein Element der Gruppe 12-16 des Periodensystems ist, X Kohlenstoff und/oder Stickstoff ist und n = 1, 2 oder 3²⁴. Zweidimensionale MXen-Flocken haben oberflächenbeendende funktionelle Gruppen, die Hydroxyl (-OH), Sauerstoff (-O) oder Fluor (-F) umfassen können. Diese funktionellen Gruppen machen MXenes von Natur aus hydrophil und ermöglichen eine flexible Oberflächenmodifikation oder -funktionalisierung. Von der großen Klasse von MXenes wurde Ti_3C2 am umfangreichsten untersucht und^{gekennzeichnet 25,26,27}. Ti₃C₂ zeigt eine bemerkenswert höhere volumetrische Kapazität (1.500 F/cm³)²⁸ als aktiviertes Graphen (ca. 60 x 100 F/cm³)²⁹, Hartmetall-kohlenstoffabgeleitete Kohlenstoffe (180 F/cm³)³⁰, und Graphen-Gel-Filme (ca. 260 F/cm³)³¹. Darüber hinaus weist Ti₃C₂ eine extrem hohe elektronische Leitfähigkeit auf (ca. 10.000 S/cm)³², und seine Biokompatibilität wurde in mehreren Studien^33,34,35,36nachgewiesen. Die hohe Volumetritrienkapazität von Ti_3C2-Folien ist für biologische Sensor- und Stimulationsanwendungen von Vorteil, da Elektroden mit kapazitiver Ladungsübertragung potenziell schädliche Hydrolysereaktionen vermeiden können.

Unsere Gruppe hat vor kurzem flexible, dünnschichtige_Ti3C₂ Mikroelektroden-Arrays gezeigt, die mit Lösungsverarbeitungsmethoden hergestellt wurden, die sowohl die Mikroelektrocortikographie (Mikro-ECoG) als auch die intracortische neuronale Spiking-Aktivität in vivo mit hohem SNR³⁶aufzeichnen können. Diese MXene-Elektroden zeigten eine signifikant reduzierte Impedanz im Vergleich zu größenangepassten Goldelektroden (Au), was auf die hohe Leitfähigkeit von MXene und die hohe Oberfläche der Elektroden zurückzuführen ist. In diesem Protokoll beschreiben wir die wichtigsten Schritte zur Herstellung planarer Mikroelektroden-Arrays von Ti_3C2 MXene auf flexiblen Parylen-C-Substraten und deren Einsatz in vivo für die intraoperative Mikro-ECoG-Aufnahme. Diese Methode nutzt die hydrophile Natur von MXene, die die Verwendung von Lösungsverarbeitungsmethoden ermöglicht, die einfach und skalierbar sind, ohne die Verwendung von Tensiden oder Supersäuren zu erfordern, um stabile wässrige Suspensionen zu erreichen. Diese einfache Verarbeitbarkeit kann die kostengünstige Herstellung von MXene-Biosensoren in industriellen Maßstäben ermöglichen, was eine wesentliche Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von Geräten auf Der Basis anderer Kohlenstoff-Nanomaterialien darstellt. Die wichtigste Innovation in der Elektrodenherstellung liegt in der Verwendung einer Opferpolymerschicht zum Mikromustern der MXene nach der Spin-Beschichtung, einem Verfahren, das aus der Literatur über lösungsbearbeitetes Poly(3,4-ethylenedioxythiophen):poly(Styrolsulfonat) (PEDOT:PSS) Mikroelektroden³⁷angepasst wurde, aber zuvor nicht für die Musterung von MXen beschrieben worden war. Die außergewöhnlichen elektrischen Eigenschaften von Ti_3C2, gepaart mit seiner Verarbeitbarkeit und 2D-Morphologie machen es zu einem sehr vielversprechenden Material für neuronale Schnittstellen. Insbesondere bietet Ti₃C₂ einen Weg zur Überwindung des grundlegenden Kompromisses zwischen Elektrodengeometriefläche und elektrochemischer Grenzflächenimpedanz, einem primären Limitierungsfaktor für die Mikroelektrodenleistung. Darüber hinaus kann das in diesem Protokoll beschriebene Herstellungsverfahren angepasst werden, um MXene-Elektroden-Arrays unterschiedlicher Größe und Geometrie für verschiedene Aufnahmeparadigmen zu erzeugen, und kann auch leicht angepasst werden, um neben MXene auch andere leitfähige Tinten zu integrieren.

Protocol

Alle In-vivo-Verfahren entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania genehmigt. 1. Synthese von Ti3C2 MXene HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Reaktionsverfahren sind für den Einsatz in einer chemischen Rauchhaube bestimmt. Die in diesem Verfahren enthaltenen Was…

Representative Results

Beispiel-Mikro-ECoG-Daten, die auf einem MXene-Mikroelektroden-Array aufgezeichnet wurden, sind in Abbildung 5dargestellt. Nach dem Auftragen des Elektrodenarrays auf den Kortex waren auf den Aufnahmeelektroden sofort klare physiologische Signale zu erkennen, wobei auf allen MXene-Elektroden etwa 1 mV Amplitude ECoG-Signale auftauchten. Leistungsspektren dieser Signale bestätigten das Vorhandensein von zwei Gehirnrhythmen, die häufig bei Ratten unter Ketamin-Dexmedetomidin-Anästhesie beob…

Discussion

Das in diesem Protokoll beschriebene MXene-Synthese- und Delaminationsverfahren (HF/HCl/LiCl) wurde aus dem MILD-Ätzansatz aufgebaut, der ein LiF/HCl (in situ HF) etchant medium²⁶verwendete. Der MILD-Ansatz ermöglicht es, große Ti_3C2-Flocken (mehrere m in seitenseitiger Größe) beim Waschen spontan zu delaminisieren, sobald der pH-Wert von 5 bis 6 erreicht wurde. Im Vergleich zur Radierung allein mit HF führt dies zu Material mit höherer Qualität und verbesserten Mater…

Materials

00-90 screw	McMaster-Carr	90910A630	Skull screw around which ground wire is wrapped
128ch stimulation/recording controller	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	REF: 352076	Used for washing
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector	Molex	505110-1892	Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board.
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector	Omnetics Connector Corporation	A79008-001	Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage.
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes	Rienar	Rienar-3ML-20PCS	Used for transferring etchant or MXene solutions
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube	Falcon	REF: 352070	Used for washing and size selection
Al etchant Type A	Transene	060-0026000-QT	For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch.
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm	Alfa Aesar	CAS: 7429-90-5	Used for MAX synthesis
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor.
Buffered Oxide Etchant 6:1	JT Baker	1178-03	For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure.
Buprenorphine SR	Wildlife Pharmaceuticals		Analgesia for rat surgery
Centrifuge	Hermle	Benchmark Z 446	Used for washing and size selection
Dexdomitor	Midwest Veterinary Supply	193.13250.3	Anesthesia for rat surgery
Drill burr	Fine Science Tools	19007-07	Burrs for drill
Electric drill	Foredom	K.1070	Micromotor drill for craniotomies
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker Company		Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Ground wire	A-M Systems	781500	Bare silver wire
Headspace Vial, glass	Supelco	REF: 27298	Used for storing MXene solutions
Hydrochloric acid (12.1N)	Fisher Scientific	CAS: 7647-01-0	Corrosive; etchant material
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O)	Acros	CAS: 7664-39-3	Etchant material
Jupiter II RIE system	March Plasma Systems Inc.		Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system.
Kapton standard polyimide tape, 1/4"	DuPont		Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector.
Ketamine	Hospital of the Univ. of Penn.		Anesthesia for rat surgery
KLA P-7 Stylus Profilometer	KLA Corporation		Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool.
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous	Acros	CAS: 7447-41-8	Hygroscopic; delamination material
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Micro-90 cleaning solution	International Products Corporation	M-9050-12	Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene
NR71-3000p photoresist	Futurrex Inc.	NR71-3000p	Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices.
Ophthalmic ointment	Midwest Veterinary Supply	193.63200.3	To prevent corneal drying during surgery
Parylene deposition system	Specialty Coating Systems		Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C
Parylene-C dimer	Specialty Coating Systems	980130-c-01lbe	Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices
Photomasks (chrome on soda lime glass)	University of Pennsylvania		Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files.
Povidone-iodine solution	Medline	MDS093901	To help prevent infection around scalp incision
Printed Circuit Board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files.
RD6 Developer	Futurrex Inc.	RD6 Developer	Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure
Reference 600 potentiostat	Gamry Instruments		Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices
Remover PG	MicroChem Corp.	G050200	Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning
RHS2000 Stim SPI interface cable	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
RHS2116 amplifier board	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
Si wafers	Wafer World	2885	Substrate for fabrication
Spin Coater	Cost Effective Equipment		For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters.
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 902	For positioning the rat for neurosurgery
Teflon-coated magnetic stir bar	Corning	REF: 1233W95	Used to stir during etching and intercalation
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm	Alfa Aesar	CAS: 12070-08-5	Used for MAX synthesis
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm	Alfa Aesar	CAS: 7440-32-6	Used for MAX synthesis
Ultrasonic bath sonicator	Reynolds Tech		For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals.
UV vis spectrophotometer	ThermoScientific	Evolution 201	Used to determine concentration and observe absorption peak
Zetasizer, Particle Size Analysis	Malvern Panalytical	Nano ZS	Used to determine particle lateral size distibution