Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante
Summary
Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.
Abstract
Em vários modelos transgênicos de zebrafish do carcinoma hepatocelular (CcH), hepatomegaly pode ser observado durante estágios larvais precoces. Quantificar o tamanho do fígado larval em modelos de HCC de zebrafish fornece um meio de avaliar rapidamente os efeitos das drogas e outras manipulações em um fenótipo relacionado ao oncogene. Aqui mostramos como consertar larvas de zebrafish, dissecar os tecidos ao redor do fígado, fotografar fígados usando microscopia de campo brilhante, medir a área hepática e analisar os resultados. Este protocolo permite quantificação rápida e precisa do tamanho do fígado. Como este método envolve medir a área hepática, pode subestimar diferenças no volume do fígado, e metodologias complementares são necessárias para diferenciar entre alterações no tamanho celular e alterações no número celular. A técnica de dissecção descrita aqui é uma excelente ferramenta para visualizar o fígado, intestino e pâncreas em suas posições naturais para inúmeras aplicações a jusante, incluindo a coloração de imunofluorescência e a hibridização situ. A estratégia descrita para quantificar o tamanho do fígado larval é aplicável a muitos aspectos do desenvolvimento e regeneração hepática.
Introduction
O carcinoma hepatocelular (CCH) é a malignidade primária mais comum do fígado1 e a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer2. Para entender melhor os mecanismos da hepatocarcinogênese e identificar potenciais terapêuticas de HCC, nós e outros desenvolvemos zebrafish transgênicos nos quais a expressão específica do hepatocito de oncogenes como β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, ou Yap18 leva ao HCC em animais adultos. Nestes zebrafish, o alargamento do fígado é observado já em 6 dias após a fertilização (DPF), fornecendo uma plataforma fácil para testar os efeitos das drogas e alterações genéticas no crescimento excessivo do fígado orientado por oncogenes. Medição precisa e precisa do tamanho do fígado larval é essencial para determinar os efeitos dessas manipulações.
O tamanho e a forma do fígado podem ser avaliados semi-quantitativamente em larvas fixas de zebrafish por CY3-SA rotulando9 ou em larvas de zebrafish vivos usando repórteres fluorescentes específicos de hepatocito e microscopia dissecante5,6. Este último método é relativamente rápido, e sua falta de precisão pode ser abordada fotografando e medindo a área de cada fígado usando software de processamento de imagem7,10. No entanto, pode ser tecnicamente desafiador posicionar uniformemente todas as larvas vivas em um experimento de tal forma que a área hepática bidimensional é uma representação precisa do tamanho do fígado. Uma técnica semelhante para quantificar o tamanho do fígado envolve o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para quantificar o volume de fígadolarval 8, o que pode ser mais preciso para detectar diferenças de tamanho quando o fígado é expandido não uniformemente em diferentes dimensões. A classificação celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para contar o número de hepatocitos fluorescentes rotulados e outros tipos de células hepáticas em fígados larvais8,11. Neste método, os fígados larvais são agrupados e dissociados, por isso se perdem informações sobre o tamanho e a forma individuais do fígado. Em combinação com outro método de determinação do tamanho do fígado, o FACS permite diferenciação entre o aumento do número celular (hiperplasia) e o aumento do tamanho celular (hipertrofia). Todos esses métodos empregam tecnologia de fluorescência cara (microscópio ou aparelho celular) e, com exceção da rotulagem CY3-SA, exigem rotulagem de hepatocitos com um repórter fluorescente.
Aqui descrevemos em detalhes um método para quantificar a área hepática larvalde zebrafish usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagem3,12,13,14. Este protocolo permite quantificação precisa da área de fígados individuais in situ sem o uso de microscopia de fluorescência. Ao analisar o tamanho do fígado, cegamos a identidade da imagem para reduzir o viés do investigador e melhorar o rigor científico15.
Protocol
Representative Results
Discussion
A quantificação do tamanho do fígado é crucial em estudos que visam entender o desenvolvimento do fígado, a regeneração e a oncogênese. O protocolo descrito aqui é uma técnica relativamente rápida, fácil e barata para quantificação do tamanho do fígado em zebrafish larval. Exercitar a cautela adequada ao realizar certos aspectos do protocolo pode ajudar no aumento da precisão dos resultados e diminuição da frustração.
A fixação adequada das larvas é crucial para obter am…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer Maurine Hobbs e o Centralizado Zebrafish Animal Resource (CZAR) da Universidade de Utah por fornecer maçaria de zebrafish, espaço de laboratório e equipamentos para realizar partes desta pesquisa. A expansão do CZAR é apoiada em parte pela subvenção do NIH # 1G20OD018369-01. Também gostaríamos de agradecer a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e o Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility por cuidados com zebrafish. Gostaríamos de agradecer a Kenneth Kompass por ajuda com a programação R. Este trabalho foi financiado em parte por subsídios da Huntsman Cancer Foundation (em conjunto com a concessão P30 CA042014 concedida ao Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
Riferimenti
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