Summary

Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

Published: February 02, 2020
doi:

Summary

Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.

Abstract

In mehreren transgenen Zebrafischmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC) kann Hepatomegalie in frühen Larvenstadien beobachtet werden. Die Quantifizierung der Larvenlebergröße in Zebrafisch-HCC-Modellen bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Medikamenten und anderen Manipulationen auf einen Onkogen-bezogenen Phänotyp schnell zu bewerten. Hier zeigen wir, wie man Zebrafischlarven fixiert, das Gewebe, das die Leber umgibt, seziert, Lebern mittels Hellfeldmikroskopie fotografiert, leberfarbene Flächen misst und Ergebnisse analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, präzise Quantifizierung der Lebergröße. Da diese Methode die Messung des Leberbereichs beinhaltet, kann es Unterschiede im Lebervolumen unterschätzen, und ergänzende Methoden sind erforderlich, um zwischen Veränderungen der Zellgröße und Veränderungen der Zellzahl zu unterscheiden. Die hier beschriebene Dissektionstechnik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse in ihren natürlichen Positionen für unzählige nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und In-situ-Hybridisierung, zu visualisieren. Die beschriebene Strategie zur Quantifizierung der Larvenlebergröße ist auf viele Aspekte der Leberentwicklung und -regeneration anwendbar.

Introduction

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre Malignität der Leber1 und die dritthäufigste Ursache der krebsbedingten Mortalität2. Um Mechanismen der Hepatokarzinogenese besser zu verstehen und mögliche HCC-Therapeutika zu identifizieren, haben wir und andere transgene Zebrafische entwickelt, bei denen hepatozytenspezifische Expression von Onkogenen wie z.B. ‘-Catenin3,4, Kras(V12)5,6, Myc7oder Yap18 zu HCC bei erwachsenen Tieren führt. Bei diesen Zebrafischen wird die Lebervergrößerung bereits 6 Tage nach der Befruchtung (dpf) festgestellt, was eine einfache Plattform für die Erprobung der Auswirkungen von Medikamenten und genetischen Veränderungen auf das Onkogen-getriebene Leberüberwuchern bietet. Genaue und genaue Messung der Larvenlebergröße ist wichtig für die Bestimmung der Auswirkungen dieser Manipulationen.

Lebergröße und -form können halbquantitativ bei festen Zebrafischlarven mit CY3-SA-Kennzeichnung9 oder bei lebenden Zebrafischlarven mit hepatozytenspezifischen Fluoreszenzreportern und Fluoreszenzsezierender Mikroskopie5,6bewertet werden. Die letztgenannte Methode ist relativ schnell, und ihre mangelnde Präzision kann durch fotografieren und messen die Fläche jeder Leber mit Bildverarbeitungssoftware7,10behandelt werden. Es kann jedoch technisch schwierig sein, alle lebenden Larven in einem Experiment einheitlich zu positionieren, so dass der zweidimensionale Leberbereich eine genaue Darstellung der Lebergröße darstellt. Eine ähnliche Technik zur Quantifizierung der Lebergröße beinhaltet die Verwendung von Lichtblattfluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Larvenlebervolumens8, was genauer sein kann, um Größenunterschiede zu erkennen, wenn die Leber in verschiedenen Dimensionen ungleichmäßig erweitert wird. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann verwendet werden, um die Anzahl der fluoreszierend gekennzeichneten Hepatozyten und andere Leberzelltypen in Larvenlebern8,11zu zählen. Bei dieser Methode werden Larvenleber gepoolt und dissoziiert, so dass Informationen über die größe und Form der einzelnen Leber verloren gehen. In Kombination mit einer anderen Methode zur Bestimmung der Lebergröße ermöglicht FACS die Unterscheidung zwischen erhöhter Zellzahl (Hyperplasie) und erhöhter Zellgröße (Hypertrophie). Alle diese Methoden verwenden teure Fluoreszenztechnologie (Mikroskop oder Zellsortierer) und erfordern, mit Ausnahme der CY3-SA-Kennzeichnung, die Kennzeichnung von Hepatozyten mit einem fluoreszierenden Reporter.

Hier beschreiben wir detailliert eine Methode zur Quantifizierung von Zebrafisch-Larvenleber-Bereich mit Hellfeldmikroskopie und Bildverarbeitungssoftware3,12,13,14. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung des Bereichs der einzelnen Lebern in situ ohne den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie. Bei der Analyse der Lebergröße blenden wir die Bildidentität, um die Voreingenommenheit der Ermittler zu reduzieren und die wissenschaftliche Strenge zu verbessern15.

Protocol

Tierversuche werden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt wurden. 1. Arven fixieren Nach 3–7 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Larven mit Tricain-Methansulfonat einschläfern (0,03%) und sammeln Bis zu 15 Larven in einem 2 ml Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe. Larven zweimal mit 1 ml Kalt (4 °C) 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis waschen. Für jede Wäsche so viel Flü…

Representative Results

Transgene Zebrafische, die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes -Catenin (Tg(fabp10a:pt—cat) Zebrafisch)3 und nicht-transgene Kontrollgeschwister exzensieren, wurden mit 6 dpf eingeschläfert und der Leberbereich wurde mit Hilfe von Brightfield-Mikroskopie- und Bildverarbeitungssoftware quantifiziert. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße (0,0006 cm2) im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern (0,0004 cm2, p < 0,0001; <strong class…

Discussion

Quantifizierung der Lebergröße ist entscheidend in Studien zum Verständnis der Leberentwicklung, Regeneration, und Onkogenese. Das hier beschriebene Protokoll ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Technik zur Quantifizierung der Lebergröße bei Larvenzebrafischen. Die angemessene Vorsicht bei der Durchführung bestimmter Aspekte des Protokolls kann zu einer höheren Genauigkeit der Ergebnisse und einer verminderten Frustration führen.

Die richtige Fixierung der Larven is…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Maurine Hobbs und die Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) an der University of Utah für die Bereitstellung von Zebrafischhaltung, Laborraum und Ausrüstung zur Durchführung von Teilen dieser Forschung danken. Die Erweiterung des CZAR wird zum Teil durch den NIH-Zuschuss Nr. 1G20OD018369-01 unterstützt. Wir möchten auch Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum und dem Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility für die Pflege von Zebrafischen danken. Wir danken Kenneth Kompass für die Unterstützung bei der R-Programmierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien der Huntsman Cancer Foundation (in Verbindung mit dem Stipendium P30 CA042014 an das Huntsman Cancer Institute) (KJE) und NIH/NCI R01CA222570 (KJE) finanziert.

Materials

Camera for dissecting microscope Leica, for example
Dissecting microscope Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps Fine Science Tools 11254-20
Glass pipets VWR 14672-608
Image analysis software Image J/FIJI ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose Sigma M0387
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline Various suppliers
Pipette pump VWR 53502-233
Plastic Petri dishes USA Scientific Inc 2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish VWR 89090-482
Software for blinding files R project R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software GraphPad Prism
Spreadsheet program Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) Western Chemical 200-226
Very fine (Dumont #55) forceps Fine Science Tools 11255-20

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kotiyal, S., Fulbright, A., O’Brien, L. K., Evason, K. J. Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy. J. Vis. Exp. (156), e60744, doi:10.3791/60744 (2020).

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