Mavi ve Kırmızı-shifted Channelrhodopsins ile Inferior Colliculus Nöronların Uzun menzilli Channelrhodopsin destekli Devre Haritalama
Summary
Channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) anatomik ve / veya genetik olarak tanımlanan nöron grupları arasında uzun menzilli nöronal projeksiyonlar fonksiyonel haritalama için hassas bir tekniktir. Burada, işitsel beyin sapı bağlantılarını haritalamak için CRACM’nin nasıl kullanılacağını anlatıyoruz, buna kırmızı-shifted opsin, ChrimsonR’ın kullanımı da dahil.
Abstract
Nöral devreleri araştırırken, in vitro yama kıskaç yaklaşımının standart bir sınırlaması, birden fazla kaynaktan gelen aksonlar genellikle birbirine karışmak, elektrikstimülasyon ile bireysel kaynaklardan girişleri izole etmek zor hale olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM) kullanılarak, bu sınırlama artık aşılabilir. Burada, düşük işitsel beyin sapı çekirdekleri ve komiser girişleri artan girdileri alt kolikulus (IC), işitsel sistemin orta beyin çekirdeği nöronların tanımlanmış bir sınıfa haritalamak için CRACM kullanmak için bir yöntem rapor. IC’de, lokal, komiser, yükselen ve azalan aksonlar yoğun bir şekilde iç içe geçmiştir ve bu nedenle elektriksel uyarılma ile ayırt edilemez. Bir presinaptik çekirdekte bir kanaloidofin ekspresyonu sürücü için viral bir yapı enjekte ederek, kanalrhodopsin ifade sinaptik girdilerin varlığı ve fizyolojisi karakterize etmek için yama kıskaç kaydı takip, belirli bir kaynaktan projeksiyonlar IC nöronların belirli bir nüfusa hücre tipine özgü doğruluk ile eşlenebilir. Bu yaklaşımın hem Mavi ışıkla aktive edilmiş channelrhodopsin chronos, hem de kırmızı vitesli bir channelrhodopsin olan ChrimsonR ile çalıştığını gösteriyoruz. Ön beyin önceki raporların aksine, biz ChrimsonR sağlam dorsal koklear çekirdek çekirdek nöronlar aksonları aşağı ticareti olduğunu bulmak, ChrimsonR beyin sapı CRACM deneyler için yararlı bir araç olabileceğini gösteren. Burada sunulan protokol, dorsal koklear çekirdeğive farelerin IC enjeksiyonlarını hedeflemek için stereotaksik koordinatlar da dahil olmak üzere intrakranial virüs enjeksiyon cerrahisinin ayrıntılı açıklamalarını ve tüm hücre yama kıskaç kaydının nasıl birleştirileceğini içerir. IC nöronlar için uzun menzilli projeksiyonlar araştırmak için channelrhodopsin aktivasyonu ile. Bu protokol, işitsel girdileri IC’ye göre karakterize etmek için tasarlanmış olsa da, işitsel beyin sapı ve ötesindeki diğer uzun menzilli projeksiyonları araştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Sinaptik bağlantılar nöral devre fonksiyonu için çok önemlidir, ancak nöral devreler içindeki sinapsların hassas topolojisi ve fizyolojisini deneysel olarak araştırmak genellikle zordur. Bunun nedeni, hücresel elektrofizyolojinin geleneksel aracı olan elektriksel stimülasyonun, stimülasyon bölgesine yakın aksonların gelişigüzel aktive edilmesidir ve çoğu beyin bölgesinde, farklı kaynaklardan (lokal, yükselen ve/veya azalan) aksonların iç içe geçmiş olmasıdır. Ancak, channelrhodopsin destekli devre haritalama (CRACM)1,2kullanarak, bu sınırlama şimdi3aşılabilir . Channelrhodopsin (ChR2) bir ışık aktive, katyon seçici iyon kanalı aslında yeşil yosun Chlamydomonas reinhardtiibulundu. ChR2 450-490 nm civarında bir dalga boyu mavi ışık ile aktive edilebilir, katyon akını ile hücre depolarize. ChR2 ilk açıklanan ve Nagel ve meslektaşları tarafından Xenopus oositler ifade4. Bundan kısa bir süre sonra, Boyden ve meslektaşları5 memeli nöronlarda ChR2 ifade ve güvenilir bir milisaniye zaman ölçeğinde spiking kontrol etmek için ışık darbeleri kullanabilirsiniz gösterdi, mavi ışık ile ChR2 aktivasyonu ndan sonra eylem potansiyelleri ~ 10 ms indükleyen. Son zamanlarda daha hızlı kinetik içeren optogenetik kanallar bulunmuştur (örneğin, Chronos6).
Bir CRACM deneyiçin temel yaklaşım bir konfotik adeno-ilişkili virüs (rAAV) bir channelrhodopsin için genetik bilgi taşıyan putatif presinaptik nöronlar bir nüfus transfect etmektir. RAAV ile nöronların transfeksiyon kodlanmış channelrhodopsin ekspresyonuna yol açar. Tipik olarak, channelrhodopsin GFP gibi bir floresan protein ile etiketlenir (Yeşil Floresan Protein) veya tdTomato (kırmızı floresan protein), böylece hedef bölgede nöronların transfeksiyon kolayca floresan görüntüleme ile teyit edilebilir. RAAVs non-patojenik olduğundan, düşük inflamatuar potansiyeli ve uzun ömürlü gen ekspresyonuvar 7,8, onlar nöronlara channelrhodopsins sunmak için standart bir teknik haline gelmiştir. Eğer, nöronların putatif presinaptik popülasyontransfeksiyon sonra, ışık yanıp söner yoluyla bir channelrhodopsin aktivasyonu mesaj yofetik potansiyelleri veya hedef nöronlarda akımlar ortaya çıkarır, Bu transfected çekirdekten kaydedilmiş hücreye aksonal bağlantı kanıtıdır. Beyin dilimi deneylerinde kopmuş aksonları channelrhodopsin aktivasyonu yoluyla nörotransmitter serbest bırakmak için tahrik edilebilir çünkü, akut dilim dışında yalan ama postsinaptik beyin bölgesine akson göndermek çekirdekleri CRACM ile tespit edilebilir. Bu tekniğin gücü, tanımlanan uzun menzilli sinaptik girdilerin bağlantısı ve fizyolojisinin doğrudan araştırılabildiğidir.
Mavi ışık tarafından heyecanlı olan kanaloidofinler ek olarak, araştırmacılar son zamanlarda birkaç kırmızı kaydırılmış channelrhodopsins tespit var9,10, Chrimson ve daha hızlı analog ChrimsonR dahil, her ikisi de ~ 660 nm6kırmızı ışık ile heyecanlıyız . Kırmızı ışık mavi ışık daha iyi doku nüfuz çünkü kırmızı kaydırılmış opsins ilgi vardır, ve kırmızı ışık mavi ışık10daha düşük bir sitotoksisite olabilir10 ,11,12. Kırmızı-shifted channelrhodopsins da aynı nöron üzerinde farklı çekirdeklerden aksonların yakınsama bir deneydetest edilebilir çift renkli CRACM deneyleri, olasılığını açmak 6,13,14. Ancak, mevcut kırmızı-shifted opsins genellikle mavi ışık 15 ile istenmeyen çapraz aktivasyonsergilemek 15,16,17, iki renk deneyleri zor hale. Buna ek olarak, bazı raporlar ChrimsonR sınırlı aksonal ticareti uğrar göstermiştir, hangi CRACM deneyleri için ChrimsonR kullanmak zor yapabilirsiniz16,17.
Alt işitsel beyin sapı çekirdeklerinden gelen neredeyse tüm yükselen projeksiyonlar, merkezi işitsel yolun orta beyin merkezi olan alt koliulusta (IC) yakınlaşır. Bu koklear çekirdeğin projeksiyonları içerir (CN)18,19, üstün olilik kompleksi en (SOC)20, ve dorsal (DNLL) ve ventral (VNLL) lateral lemniscus çekirdekleri21. Ayrıca, işitsel korteksten büyük bir azalan projeksiyon IC sona erer18,19,20,21,22, ve IC nöronlar kendilerini ic yerel ve kontralateral loblar içinde geniş sinaps23. Birçok kaynaktan aksonların içiçe olması, ic devrelerinin elektriksel stimülasyon kullanılarak sondalanmasını zorlaştırmıştır24. Sonuç olarak, IC nöronlar ses lokalizasyonu ve konuşma ve diğer iletişim sesleri nin belirlenmesi için önemli hesaplamalar gerçekleştirmek rağmen25,26, IC nöral devrelerin organizasyonu büyük ölçüde bilinmemektedir. Yakın zamanda IC27’dekiilk moleküler olarak tanımlanabilir nöron sınıfı olarak VIP nöronları tanımladık. VIP nöronlar, işitsel talamus ve üstün kolikulus da dahil olmak üzere birçok uzun menzilli hedefe proje glutamaterjik stellat nöronlardır. Artık VIP nöronlara yerel ve uzun menzilli girdilerin kaynaklarını ve işlevini ve bu devre bağlantılarının ses işlemeye nasıl katkıda bulunduğunu belirleyebiliyoruz.
Burada sunulan protokol, özellikle kontralateral IC ve DCN’den(Şekil 1)farelerin IC’sindeki VIP nöronlara sinaptik girdilerin araştırılması için uyarlanmıştır . Protokol kolayca giriş farklı kaynaklara adapte edilebilir, farklı bir nöron tipi veya tamamen farklı bir beyin bölgesi. Ayrıca ChrimsonR’ın işitsel beyin sapında uzun menzilli devre haritalaması için etkili bir kırmızı kaydırmalı kanalrhodopsin olduğunu da gösteriyoruz. Ancak, ChrimsonR güçlü mavi ışık tarafından aktive olduğunu göstermektedir, düşük yoğunluklarda bile, ve böylece, iki renkli CRACM deneylerde Chronos ile ChrimsonR birleştirmek için, dikkatli kontroller ChrimsonR çapraz aktivasyonu önlemek için kullanılmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cracm’nin fare IC’deki nöronlara uzun menzilli sinaptik girdileri tanımlamak ve karakterize etmek için güçlü bir teknik olduğunu bulduk. Burada ayrıntılı olarak yapılan protokolü takiben, DCN ve IC’deki nöronların sağlam transfeksiyonunun yanı sıra Chronos ve ChrimsonR’ın IC’deki sinaptik terminallere güvenilir aksonal ticareti sağladık. Ayrıca, bu tekniğin PSP genliği, yarıgenişlik, çürüme süresi ve reseptör farmakolojisi de dahil olmak üzere postsinaptik olayların ölçülmesini ve anal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, proje numarası 401540516, DG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R56 DC016880 (MTR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
Riferimenti
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetica. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. . The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
