Magnetische Anpassung der Nachbelastung in technischen Herzgeweben
Summary
Dieses Protokoll enthält detaillierte Methoden, die die Herstellung und Implementierung einer magnetisch basierten Afterload-Tuning-Plattform für technisches Herzgewebe beschreiben.
Abstract
Afterload ist dafür bekannt, die Entwicklung von physiologischen und pathologischen Herzzuständen voranzutreiben. Daher könnte die Untersuchung der Ergebnisse veränderter Nachladezustände wichtige Einblicke in die Mechanismen liefern, die diese kritischen Prozesse steuern. Eine experimentelle Technik zur präzisen Feinabstimmung der Nachbelastung im Herzgewebe im Laufe der Zeit fehlt jedoch derzeit. Hier wird eine neu entwickelte magnetisch basierte Technik zur Erreichung dieser Kontrolle in technischen Herzgeweben (EHTs) beschrieben. Um magnetisch reagierende EHTs (MR-EHTs) herzustellen, werden die Gewebe auf hohlen Silikonpfosten montiert, von denen einige kleine Permanentmagnete enthalten. Ein zweiter Satz Permanentmagnete wird so in eine Acrylplatte eingelassen, dass sie mit der gleichen Polarität ausgerichtet und axial mit den Postmagneten ausgerichtet sind. Um die Nachlast einzustellen, wird diese Platte von Magneten in Richtung (höhere Nachlast) oder weg (niedrigere Nachlast) von den Postmagneten mit einer piezoelektrischen Stufe mit einem Encoder übersetzt. Die Bewegungssteuerungssoftware zur Einstellung der Bühnenpositionierung ermöglicht die Entwicklung benutzerdefinierter Nachlastschemas, während der Encoder sicherstellt, dass die Stufe alle Inkonsistenzen an seinem Standort korrigiert. Diese Arbeit beschreibt die Herstellung, Kalibrierung und Implementierung dieses Systems, um die Entwicklung ähnlicher Plattformen in anderen Labors auf der ganzen Welt zu ermöglichen. Repräsentative Ergebnisse aus zwei separaten Experimenten sind enthalten, um die Bandbreite der verschiedenen Studien zu veranschaulichen, die mit diesem System durchgeführt werden können.
Introduction
Nachladen ist die systolische Belastung des Ventrikels, nachdem er begonnen hat, Blut auszuwerfen1. Während der Herzentwicklung ist eine geeignete Nachbelastung von entscheidender Bedeutung für die Kardiomyozytenreifung2. Im Erwachsenenalter können niedrige Konzentrationen ventrikulärer Nachbelastungen (z. B. bei bettlägerigen Patienten mit hoher Rückenmarksverletzung3 oder in sehr speziellen Fällen wie Raumflug4)zu einer Hypotrophie des Herzens führen. Umgekehrt kann eine hohe Nachbelastung zu einer Herzhypertrophie führen5. Während Herzhypertrophie bei Ausdauersportlern oder schwangeren Frauen als vorteilhaft und physiologisch gilt, Hypertrophie im Zusammenhang mit langfristiger arterieller Hypertonie oder schwerer Aortenklappenstenose ist schädlich, da es eine prädisponiert herzherzherzige Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz6. Obwohl die 5-Jahres-Sterblichkeitsrate für Herzinsuffizienzpatienten von 70 % in den 1980er Jahrenum 6 % auf 40–50 %7 gesunken ist, besteht nach wie vor ein großer Bedarf an neuen therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten für diesen weit verbreiteten Zustand (derzeit 2,2 % der Bevölkerung in der westlichen Welt)8.
Um die molekularen Mechanismen der pathologischen Herzhypertrophie zu untersuchen und präventive oder therapeutische Strategien zur Behandlung dieser Krankheit zu testen, wurden in vivo Modelle der Nachbelastungentwickelt 9,10,11,12. Diese Modelle bieten zwar positive Einblicke in die Auswirkungen der Nachbelastung auf die ventrikuläre Leistung, erlauben jedoch keine feine Kontrolle über die Nachlastgröße. Alternativ ermöglichen In-vitro-Studien mit Nachbelastungen an ausgeschnittenen Herzen und Muskelpräparaten eine feinere Kontrolle der Gewebebelastung, aber diese Modelle sind nicht förderlich für Längsstudien13,14,15.
Um diese Probleme zu überwinden, entwickelten wir ein In-vitro-Modell erhöhter Nachbelastung in technischen Herzgeweben (EHTs)16,17. Dieses Modell ist ein dreidimensionales Kulturformat für Rattenherzzellen, eingebettet in eine Fibrinmatrix, die zwischen flexiblen Hohlsilikonpfosten aufgehängt ist. Diese Gewebe schlagen spontan (gegen die Widerstandsfähigkeit der Silikonpfosten) und führen auxotonic Arbeit. Wir haben die Nachlast, die in früheren Experimenten auf EHTs angewendet wurde, um den Faktor 12 erhöht, indem wir eine Woche lang starre Metallstützen in die hohlen Silikonpfosten eingesetzt haben. Dies führte zu einer Vielzahl von Veränderungen, charakteristisch für pathologische Herzhypertrophie18,19,20: Kardiomyozytenhypertrophie, partielle Nekkropotose, ein Rückgang der kontraktilen Kraft, die Beeinträchtigung der Gewebeentspannung, Reaktivierung des fetalen Genprogramms, eine metabolische Verschiebung von der Fettsäureoxidation zu anaeroben Glykolyse, und eine Zunahme der Fibrose. Obwohl dieses Verfahren in mehreren Studien erfolgreich eingesetzt wurde17,21,22, hat es einige Nachteile. Es gibt nur zwei Zustände, niedrige oder sehr hohe (12-fache) Nachlast, und das Verfahren erfordert eine manuelle Handhabung der EHTs, die ihre zeitliche Flexibilität einschränkt und das Risiko einer Kontamination darstellt.
Vor kurzem, Leonard et al. verwendet eine ähnliche Technik, um Nachladung in EHTs kultiviert auf Silikonpfosten23zu modulieren. Zahnspangen unterschiedlicher Länge wurden um die Außenseite der Pfosten gelegt, um ihre Biegebewegung einzuschränken. Die Autoren dieser Studie berichteten, dass eine einzigartige kleine bis mittlere Erhöhung der Last verbesserte Kraftentwicklung und Reifung von menschlichen iPS-abgeleiteten EHTs, während höhere Belastungen zu einem pathologischen Zustand führten. Ähnlich wie unser eigenes System erlaubt diese Technik jedoch nur eine einmalige Erhöhung der Nachlast, deren Größe durch die Länge der Klammern diktiert wird. Daher sind feine Änderungen in der Nachlast, Änderungen der Nachlast im Zeitverlauf und präzise Ladeschemas mit diesen Techniken nicht möglich.
Hier stellen wir das Protokoll für ein System zur Verfügung, mit dem der Nachwiderstand moduliert werden kann, d.h. nach dem Abladen von EHTs magnetisch24. Diese Plattform erleichtert die Feinabstimmung von Afterload, ermöglicht benutzerdefinierte Nachlastschemas und sorgt für EHT-Sterilität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine neue Technik zur magnetischen Veränderung der Nachlast in technischen Herzgeweben. Diese Technik beruht auf der Verwendung einer piezoelektrischen Stufe, um eine Platte mit starken Magneten in Richtung und weg von magnetisch reagierenden Racks von Silikonpfosten zu übersetzen. Je näher die beiden Magnetsätze, desto stärker die Nachladung, die die EHTs auf ihnen kultiviert haben.
Es gibt mehrere Schritte, die für die erfolgreiche Produktion …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Jutta Starbatty für ihre Unterstützung in der Gewebekulturarbeit, Axel Kirchhof für Fotografie, Alice Casagrande Cesconetto für die Schnittarbeit und ein besonderer Dank an Bülent Aksehirlioglu für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieses Gerätes. B.B. wurde von einem DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Scholar Grant, M.L.R. von einem Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant und M.N.H. mit Mitteln der DZHK unterstützt.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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