工程心脏组织中后负荷的磁调节
Summary
该协议提供了详细的方法，描述了基于磁性的后负荷调谐平台的制造和实现，用于工程心脏组织。
Abstract
后负荷是已知的推动生理和病理性心脏状态的发展。因此，研究改变后负荷状态的结果可以对控制这些关键过程的机制产生重要的见解。然而，目前缺乏一种实验技术，可以精确微调心脏组织中随时间的后负荷。本文介绍了一种基于磁性的新技术，用于在工程心脏组织（EHTs）中实现这种控制。为了产生磁响应的 EHT （MR-EHT），组织安装在空心硅胶柱上，其中一些它们含有小型永磁体。第二组永磁体被压入丙烯酸板中，因此它们以相同的极性定向，并与后磁体轴向对齐。为了调整后载，使用装有编码器的压电级从后磁体（更高的后负载）或离去（较低的后负载）上转换此板磁铁。用于调整阶段定位的运动控制软件允许开发用户定义的后加载方案，而编码器可确保该阶段纠正其位置中的任何不一致。本工作描述了该系统的制造、校准和实施，以便在全球其他实验室开发类似的平台。包括两个独立实验的代表性结果，以举例说明可使用此系统进行的不同研究的范围。
Introduction
后负荷是心室收缩负荷后，它已经开始弹出血液1。在心脏发育期间，适当的后负荷对心肌酸成熟至关重要2。在成年后，心室后负荷水平低（例如，在卧床不起的脊髓损伤3或非常特殊的情况下，如太空飞行4）可能导致心脏萎缩。相反，高后负荷可能导致心脏肥大5。虽然耐力运动员或孕妇的心脏肥大被认为是有益的和生理的，与长期动脉高血压或严重的主动脉瓣狭窄相关的肥大是有害的，因为它容易导致心脏心律失常和心力衰竭6。虽然心力衰竭患者的5年死亡率从20世纪80年代的70%下降到目前的40-50%7，但仍然非常需要新的治疗方案7，以治疗这种高度普遍的情况（目前占西方人口的2.2%）8。8
为了研究病理性心脏肥大的分子机制，并测试治疗这种疾病的预防或治疗策略，在体内已经开发了99，10，11，12。10,11,12虽然这些模型提供了有益的见解后负荷对心室性能的影响，他们不允许精细控制后负荷幅度。或者，对切除心脏和肌肉制剂进行后负荷的体外研究可以更精细地控制组织负荷，但这些模型不利于纵向研究13、14、15。13,14,15
为了克服这些问题，我们开发了工程心脏组织（EHTs）16、17中高后负荷的体16,17外模型。该模型是一种三维培养格式，用于嵌入在柔性空心硅胶柱之间悬浮在纤维蛋白基质中的大鼠心脏细胞。这些组织自发地跳动（对抗硅胶柱的电阻），并执行辅助性工作。在以前的实验中，通过将硬金属支架插入空心硅胶柱，将应用于 EHT 的后负载增加了 12 倍，这导致了许多变化，病理性心脏肥大的特点18，19，20：心肌细胞肥大，部分肾病，收缩力下降，组织放松受损，胎儿基因计划的恢复，代谢转变从脂肪酸氧化到厌氧糖解，以及纤维化增加。18,19,20虽然这个程序已经成功地应用于几项研究17，21，22，它有一些缺点。17,21,22卸载后只有两种状态，即低或非常高（12 倍），该过程需要手动处理 EHT，这限制了其时间灵活性，并带来了污染风险。
最近，Leonard等人使用类似的技术来调节在硅胶柱23上培养的EHT的后负荷。不同长度的支架被放置在柱子外侧，以限制其弯曲运动。这项研究的作者报告说，负载的中度单次增加增强了人类iPS衍生EHT的力发展和成熟，而高负荷则导致病理状态。然而，与我们自己的系统类似，这种技术只允许后负载的奇异增加，其大小由大括号的长度决定。因此，使用这些技术，无法对后装进行细微的改动、随时间而改变后装和精确的装载方案。
在这里，我们为一个可用于调节后电阻的系统提供了协议，即电磁24的EHT后负载。该平台便于对后装进行微调，启用用户定义的后加载方案，并确保 EHT 无菌性。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文概述的协议描述了一种在工程心脏组织中磁改变后负荷的新技术。该技术依靠压电级将一盘强磁体转化为硅胶柱的磁响应式机架。两组磁铁越接近，EHT 在它们上培养的后负载就越强。
有几个步骤对于此系统的成功生产和使用至关重要。在制造磁响应硅胶机架时，确保柱体内的所有磁体都以相同的极性定向至关重要。如果磁体置于相反的方向，它将削弱而不是增强磁场的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢朱塔·斯塔巴蒂在组织文化工作方面的支持，阿克塞尔·基希霍夫的摄影，爱丽丝·卡萨格兰德·塞斯科内托的编辑工作，以及特别感谢贝伦特·阿克塞希尔利奥卢在开发该设备方面提供技术支持。B.B.由德国心血管研究中心（德国心血管研究中心）学者格兰特、惠特克国际博士后学者格兰特和M.N.H.基金支持。
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
Riferimenti
- Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. . Braunwald’s Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).
- McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
- de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
- Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
- Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
- Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
- Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
- Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
- Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
- Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
- Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).
- Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
- Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
- Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
- Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
- Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
- Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
- Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
- Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
- Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
- Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).
