Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

Summary

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung biologischer Kryoproben für Synchrotron-basierte Röntgenabsorptionsspektroskopie-Experimente vor. Wir beschreiben alle Schritte, die zur Optimierung der Probenvorbereitung und Kryokonservierung erforderlich sind, anhand von Beispielen für das Protokoll mit Krebs- und Phytoplanktonzellen. Diese Methode bietet einen universellen Standard für die Kryopräparation von Proben.

Abstract

Die Untersuchung von Elementen mit Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) ist von besonderem Interesse, wenn es darum geht, die Rolle von Metallen in biologischen Systemen zu untersuchen. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiges und oft komplexes Verfahren, insbesondere für biologische Proben. Obwohl Röntgenspeziationstechniken weit verbreitet sind, wurde noch kein detailliertes Protokoll für Benutzer der Technik verbreitet. Darüber hinaus ist die Modifikation des chemischen Zustands besorgniserregend, und kryobasierte Techniken werden empfohlen, um die biologischen Proben in ihrem fast nativen hydratisierten Zustand zu analysieren, um die maximale Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen oder Gewebe zu gewährleisten. Hier schlagen wir ein zelluläres Präparationsprotokoll vor, das auf kryokonservierten Proben basiert. Es wird in einer hochauflösenden fluoreszenzdetektierten Röntgenabsorptionsspektroskopie von Selen in Krebszellen und einer Studie von Eisen in Phytoplankton demonstriert. Dieses Protokoll kann mit anderen biologischen Proben und anderen Röntgentechniken verwendet werden, die durch Bestrahlung beschädigt werden können.

Introduction

Die Untersuchung der zellulären Biotransformationen essentieller oder toxischer Elemente erfordert Speziationstechniken mit hoher Empfindlichkeit und sollte die Probenvorbereitungsschritte minimieren, die häufig zur Modifikation chemischer Spezies neigen.

Es ist bekannt, dass physiologische Elemente wie Selen und Eisen aufgrund ihrer komplexen Chemie, der verschiedenen Eigenschaften der Selen- oder Eisenspezies und ihrer geringen Konzentration im ppm- (mg/kg) oder sogar sub-ppm-Bereich besonders schwer zu speziieren sind. Daher kann das Studium der Speziation dieser Elemente durch XAS äußerst schwierig sein. Synchrotron XAS und insbesondere hochauflösende fluoreszenzdetektierte XAS (HERFD-XAS), die ein sehr niedriges Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis¹ ermöglichen, stehen an Synchrotronquellen zur Verfügung, um hochverdünnte Elemente in komplexen biologischen Matrizen zu spezitieren ^2,3. Herkömmliche Fluoreszenz-XAS-Messungen können mit einem energieaufgelösten Festkörperdetektor (SSD) mit einer Energiebandbreite von ~150–250 eV auf der CRG-FAME-Beamline an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴ durchgeführt werden, während HERFD-XAS-Messungen ein Kristallanalysatorspektrometer (CAS) mit einer Energiebandbreite von ~1–3 eV auf der CRG-FAME-UHD-Beamline am ESRF² benötigen. . Fluoreszenzphotonen werden hinsichtlich ihrer Energie bei elektronischen bzw. optischen Verfahren diskriminiert.

Die Kryopräparation der Probe ist unerlässlich, um Strukturen zu erhalten und die chemische Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten, wodurch eine Analyse nahe am biologischen nativen Zustand^{ermöglicht wird 5}. Darüber hinaus ermöglichen Analysen, die bei kryogenen Temperaturen von bis zu 10 K mit flüssiger heliumkryogener Kühlung (LN₂) durchgeführt werden, eine Verlangsamung der Strahlenschäden und die Erhaltung der Elementartbildung für XAS. Obwohl einige Übersichtsarbeiten zu XAS-Techniken, die auf biologische Proben angewendet werden, die Notwendigkeit der Vorbereitung und Analyse von Proben unter kryogenen Bedingungen berichten (z. B. Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), beschreibt keiner von ihnen eindeutig das zugehörige detaillierte Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird ein Verfahren zur Kryopräparation von Krebszellen und Planktonmikroorganismen für die HERFD-XAS-Speziation von Se⁸ und Fe⁹ bei kryogener Temperatur beschrieben.

Gute Praktiken für die Probenvorbereitung und -umgebung bei hochmodernen XAS-Spektroskopiemessungen erfordern 1) eine Einrichtung; 2) ein Analyseverfahren, das die Auswirkungen von Strahlenschäden so weit wie möglich begrenzt; und 3) eine Probe (oder Modellverbindungsreferenz), die in Bezug auf die Strahlgröße der Röntgenphotonen so homogen wie möglich ist. Der erste Punkt wird berücksichtigt, indem die Erfassung bei niedriger Temperatur unter Verwendung eines flüssigen Heliumkryostaten durchgeführt wird. Der zweite Punkt wird behandelt, indem jede Akquisition auf einem frischen Bereich der Probe durchgeführt wird, indem sie in Bezug auf den Balken bewegt wird. Unter Berücksichtigung der dritten Bedingung werden schließlich Proben (Pellets) und Referenzen (Pulver) in gepressten Bulk-Pellets konditioniert, um Porositäten und Inhomogenitäten so weit wie möglich zu begrenzen und Rauheiten in Bezug auf die Strahlgröße auf der röntgensondierten Probenoberfläche zu vermeiden. Wir erklären, wie das Protokoll mit all diesen Punkten umgeht.

Wir verwendeten die humane Prostatazelllinie PC-3 (hohes metastasierendes Potenzial) und die Eierstockzelllinie OVCAR-3 (die bis zu 70% aller Eierstockkrebsfälle ausmacht), um die antiproliferativen Eigenschaften von Krebszellen von Selennanopartikeln (Se-NPs) und Phaeodactylum tricornutum diatomee als Modellspezies zur Untersuchung der Eisensequestrierung in Phytoplankton zu untersuchen.

Protocol

1. Herstellung der humanen PC-3- und OVCAR-3-Krebszellpellets für die Selenspeziation HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Weekley et al.10 übernommen. Alle Schritte müssen unter einer Zellkulturhaube unter Bedingungen und Einschränkungen der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zellzählkammer. Samen Sie 150.000-200.000 Zellen pro Flasche für die PC-3-Zelllinie u…

Representative Results

Die Hauptziele dieser Präparate waren die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Selen-Nanopartikeln (Se-NPs) und Krebszellen sowie der Eisenbindung und -sequestrierung in Phytoplankton. HERFD-XANES-Spektren des Selens im Anfangszustand (BSA Se-NPs) und in Zellen im Nährmedium (BSA Se-NPs nach 24 h Inkubation) sind in Abbildung 10 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Selen in den anfänglichen Se-NPs sowohl als Se(0)- als auch als selenitähnli…

Discussion

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die chemische Form von Selen und Eisen in biologischen Proben durch Röntgenabsorptionsspektroskopie zu untersuchen. Es konzentriert sich auf die Kryopräparation und Lagerung von biologischen Proben und Referenzverbindungen sowie auf die HERFD-XAS-Messungen.

Kryo-Aufbereitung und Lagerung
Die Kryo-Aufbereitung der biologischen Probenpellets ermöglicht die Erhaltung der chemischen Integrität der in den Proben vorhandenen Spezies. Dies …

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C