Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq
Summary
Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.
Abstract
Os queratinócitos primários humanos são frequentemente usados como modelos in vitro para estudos sobre diferenciação epidérmica e doenças relacionadas. Métodos têm sido relatados para diferenciação in vitro de queratinócitos cultivados em modos submersos (2D) bidimensionais (2D) usando várias condições de indução. Descrito aqui é um procedimento para método de diferenciação de queratinócito in vitro 2D por inibição de contato e subsequente caracterização molecular por RNA-seq. Resumindo, os queratinócitos são cultivados em meio de queratinócito definido complementado com fatores de crescimento até que estejam totalmente confluentes. A diferenciação é induzida por contatos próximos entre os queratinócitos e estimulada pela exclusão dos fatores de crescimento no meio. Utilizando análises de RNA-seq, mostra-se que ambos os queratinócitos diferenciados exibem assinaturas moleculares distintas durante a diferenciação e 2) o padrão dinâmico de expressão genética se assemelha em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Quanto à comparação com a diferenciação normal de queratinócitos, os queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 apresentam morfologia alterada e assinaturas moleculares, consistentes com seus defeitos de diferenciação. Em conclusão, este protocolo detalha as etapas para a diferenciação de queratinócitos in vitro 2D e sua caracterização molecular, com ênfase na análise bioinformática dos dados RNA-seq. Como a extração de RNA e os procedimentos de RNA-seq foram bem documentados, não é o foco deste protocolo. O procedimento experimental de diferenciação de queratinócito in vitro e pipeline de análise bioinformática pode ser usado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.
Introduction
Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme1,2,3,4. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift2,3,5,6,7. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais importantes para avaliar a estrutura e a função epidérmica, os modelos de diferenciação 2D ainda são amplamente utilizados, devido à sua conveniência e à possibilidade de gerar um grande número de células para análises.
Várias condições têm sido aplicadas para induzir a diferenciação de queratinócitos em 2D, incluindo adição de soro, alta concentração de cálcio, menor temperatura e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico2,3. Cada um desses métodos foi validado por uma série de genes marcadores de diferenciação de queratinacitos e mostrou-se eficaz na avaliação da diferenciação de queratinócitos, inclusive em condições patológicas. No entanto, essas condições de indução também mostram diferenças em sua eficiência de diferenciação e cinética quando painéis específicos de genes marcadores são examinados2,3.
Um desses métodos envolve a inibição do contato queratinócito e o esgotamento dos fatores de crescimento no meio da cultura8. Foi demonstrado que os queratinócitos podem se diferenciar espontaneamente quando as células atingem a densidade máxima. A exclusão dos fatores de crescimento no meio da cultura pode aumentar ainda mais a diferenciação. O método que combina inibição de contato e esgotamento dos fatores de crescimento tem se mostrado para gerar queratinócitos diferenciados com padrões de expressão genética semelhantes à epiderme estratificada normal ao usar vários marcadores epidérmicos3,sugerindo que este modelo é adequado para estudar a diferenciação normal de queratinócitos. Recentemente, duas análises abrangentes de expressão genética da diferenciação de queratinócitos utilizando este modelo foramrelatadas 9,10. Os pesquisadores validaram esse modelo a nível molecular e mostraram que ele pode ser usado para estudar a diferenciação normal e doente do queratinócito.
Este protocolo descreve o procedimento para o método de diferenciação in vitro e análise molecular de células diferenciadas usando RNA-seq. Também ilustra a caracterização do transcriptome das células no dia 0 de diferenciação (estágio de proliferação), dia 2, dia 4 e dia 7 (diferenciação precoce, média e tardia, respectivamente). É mostrado que que queratinócitos diferenciados exibem padrões de expressão genética que se assemelham em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Para examinar se esse método pode ser usado para estudar a patologia da pele, aplicamos o mesmo pipeline experimental e de análise para investigar queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 derivados de pacientes com displasia ectodérmica e fissura/fissura (CEE)síndrome 11,12. Este protocolo se concentra na diferenciação in vitro de queratinócitos, bem como na análise bioinformática subsequente do RNA-seq. Outras etapas do procedimento completo, como extração de RNA, preparação de amostras de RNA-seq e construção de biblioteca, são bem documentadas e podem ser facilmente seguidas, especialmente quando se usa muitos kits comerciais comumente usados. Portanto, essas etapas são descritas apenas brevemente no protocolo. Os dados mostram que este gasoduto é adequado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve um método para induzir a diferenciação de queratinócitos humanos e a caracterização subsequente utilizando análises de RNA-seq. Na literatura atual, muitos estudos sobre diferenciação de queratinócitos humanos utilizam dois outros métodos, com alta concentração de cálcio ou com soro como métodos para induzir diferenciação2,3,23. Um relatório anterior comparou cuidadosamente esses três m?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bolsa da Universidade Radboud (H.Z.); e bolsa do Conselho de Bolsas chinês 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
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