Многофотонные микроскопические наблюдения сосудов в ткани печени мыши
Summary
В этом эксперименте, мышь вводится в его хвостовой вены с родамин B изотиоцианат-декстран, который может испачкать кровеносные сосуды. После того, как печень подвергается воздействию и фиксированной, определенная часть печени может быть выбран для наблюдения глубоких тканей в живом теле с помощью мультифотонной микроскопии.
Abstract
Наблюдение за внутрисосудистой динамикой тканей печени мыши позволяет проводить дальнейшие углубленные наблюдения и исследования заболеваний печени мыши, связанных с тканями. Мышь вводится с красителем, который может окрашивать кровеносные сосуды. Для наблюдения мыши печени in vivo, он подвергается и фиксируется в кадре. Двух- и трехмерные изображения кровеносных сосудов в тканях печени получены с помощью многофотонного микроскопа. Изображения тканей на выбранных участках постоянно приобретаются для наблюдения за долгосрочными изменениями; также наблюдаются динамические изменения кровеносных сосудов в тканях печени. Мультифотонная микроскопия является методом наблюдения за клеточной и клеточной функцией в глубоких секциях тканей или органах. Мультифотонная микроскопия имеет чувствительность к микроструктуре тканей и позволяет осуществлять визуализацию биологических тканей с высоким пространственным разрешением in vivo, обеспечивая возможность захвата биохимической информации организации. Мультифотонная микроскопия используется для наблюдения части печени, но фиксация печени, чтобы сделать изображение более стабильным является проблематичным. В этом эксперименте используется специальная вакуумная присоска для фиксации печени и получения более стабильного изображения печени под микроскопом. Кроме того, этот метод можно использовать для наблюдения за динамическими изменениями специфических веществ в печени путем маркировки таких веществ красителями.
Introduction
Кровеносные сосуды могут обеспечить питательными веществами различные органные ткани человеческого организма, а также обмениваться веществами. В то же время, многие цитокины, гормоны, наркотики и клетки также функционируют через сосудистый транспорт в определенные места. Наблюдение за сосудистыми изменениями в тканях печени может помочь в понимании распределения кровотока в тканях печени и транспортировки веществ, а также помочь в анализе некоторых сосудистыхзаболеваний 1,2.
Есть много способов наблюдать кровеносные сосуды печени у мышей. Среди них оптическая микроскопия имеет много ограничений в наблюдении непрозрачной сосудистой ткани3. Мультифотонная микроскопия может быть использована для изображения кровеносных сосудов живой печени с неинвазивным высоким разрешением4. Не только трехмерные изображения кровеносных сосудов могут быть получены, но метод также может быть использован, чтобы помочь организовать ткани для наблюдения биологического воздействия в нем; кроме того, вся ткань может быть изображена, а не только микровесселей, как в компьютерной томографии и магнитно-резонанснойтомографии 5.
Мультифотонная микроскопия может быть использована для эффективного обнаружения рассеянных флуоресцентных сигналов в глубокой живой ткани, с меньшейфототоксичности 6. Таким образом, активность живой ткани может быть обеспечена, и сумма ущерба может быть уменьшена. Мультифотонная микроскопия имеет лучшую проникающую силу, чем конфокальные микроскопии, что позволяет болееглубокие слои, которые будут наблюдаться 7, обеспечивая уникальную 3D-изображения. Мультифотонная микроскопия в настоящее время часто используется в визуализациичерепных нервов 8 и была распространена на изучение нейрональной динамики уживых мышей 9,10,11.
В этом эксперименте, после флуоресцентной маркировки кровеносных сосудов мыши, печень фиксируется в раме, а динамику кровеносных сосудов в живой ткани печени можно увидеть с помощью мультифотонной микроскопии. Этот эксперимент демонстрирует, как маркировать конкретные вещества, использовать мультифотонную микроскопию, чтобы помочь наблюдать расположение в ткани, наблюдать клеточные события в межклеточной ткани, делатьфотохимические измерения 12,13,14, и наблюдать за динамикой материала внутри живойткани 15. Например, эндотелиальный маркер опухоли 1 (TEM1) был определен как новый маркер поверхности, регулируемый на кровеносных сосудах и строме во многих твердых опухолях, отмечая одноко цепной переменный фрагмент (scFv) 78 против TEM1, а затем мультифотонную микроскопию можно использовать для расположения гемангиомы мышии оценки опухолей 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наблюдение за конкретной живой ткани является эффективным средством понимания изменений, локализации и биологического воздействия материала внутриткани 17. В этом эксперименте важными шагами являются фиксация печени с помощью прибора для визуализации органов, который м?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81772133, 81902444), Гуандун природных наук фонда (2020A1515010269, 2020A1515011367), Гуанчжоу гражданина науки и техники научно-исследовательский проект (201803010034, 201903010072), и военно-медицинский инновационный проект (17CX-008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Riferimenti
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
