المراقبة المجهرية متعددة الفوتون للأوعية في أنسجة كبد الفأر
Summary
في هذه التجربة، يتم حقن الماوس في الوريد الذيل مع رودامين B isothiocyanate-dextran التي يمكن أن وصمة عار الأوعية الدموية. بعد تعرض الكبد وإصلاحه ، يمكن اختيار جزء محدد من الكبد لمراقبة الأنسجة العميقة في الجسم الحي باستخدام المجهر متعدد الفوتون.
Abstract
مراقبة ديناميات داخل الأوعية الدموية من أنسجة الكبد الماوس يسمح لنا لإجراء مزيد من الملاحظات المتعمقة والدراسات على الأمراض المرتبطة بالأنسجة من كبد الفأر. يتم حقن الماوس بصبغة يمكن أن تلطخ الأوعية الدموية. لمراقبة كبد الماوس في الجسم الحي ، يتم كشفه وإصلاحه في إطار. يتم الحصول على صور ثنائية وثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية في أنسجة الكبد باستخدام مجهر متعدد الفوتون. يتم الحصول على صور الأنسجة في المواقع المختارة باستمرار لمراقبة التغيرات على المدى الطويل؛ ويلاحظ أيضا التغيرات الديناميكية للأوعية الدموية في أنسجة الكبد. المجهر متعدد الفوتون هو وسيلة لمراقبة وظيفة الخلية والخلية في أقسام الأنسجة العميقة أو الأعضاء. يتميز المجهر متعدد الفوتون بحساسية تجاه البنية المجهرية للأنسجة ويمكن من تصوير الأنسجة البيولوجية بدقة مكانية عالية في الجسم الحي ، مما يوفر القدرة على التقاط المعلومات الكيميائية الحيوية للمنظمة. يستخدم المجهر متعدد الفوتون لمراقبة جزء من الكبد ولكن تحديد الكبد لجعل الصورة أكثر استقرارا هو إشكالية. في هذه التجربة ، يتم استخدام كوب شفط فراغ خاص لإصلاح الكبد والحصول على صورة أكثر استقرارا للكبد تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة التغيرات الديناميكية لمواد محددة في الكبد عن طريق وضع علامات على هذه المواد بالأصباغ.
Introduction
يمكن للأوعية الدموية توفير المواد الغذائية لمختلف أنسجة الأعضاء في جسم الإنسان، وتبادل المواد. وفي الوقت نفسه، تعمل العديد من السيتوكينات والهرمونات والأدوية والخلايا أيضا من خلال نقل الأوعية الدموية إلى مواقع محددة. يمكن أن تساعد مراقبة التغيرات الوعائية في أنسجة الكبد في فهم توزيع تدفق الدم في أنسجة الكبد ونقل المواد ، والمساعدة في تحليل بعض الأمراض المرتبطة بالأوعية الدموية1،2.
هناك العديد من الطرق لمراقبة الأوعية الدموية للكبد في الفئران. من بينها ، المجهر البصري له العديد من القيود في مراقبة الأنسجة الوعائية المبهمة3. يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لتصوير الأوعية الدموية للكبد الحية بدقة عالية غير باضعة4. لا يمكن فقط الحصول على صور ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية ، ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للمساعدة في تنظيم الأنسجة لمراقبة الآثار البيولوجية فيها ؛ وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الأنسجة بأكملها بدلا من الميكروفسيل فقط كما هو الحال في التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي5.
يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتونات للكشف الفعال عن إشارات الفلورسنت المتناثرة في الأنسجة الحية العميقة ، مع أقل سميةضوئية 6. لذلك ، يمكن ضمان نشاط الأنسجة الحية ، ويمكن تقليل كمية الضرر. Microscopy multiphoton لديه قوة اختراق أفضل من المجهر confocal ، مما يسمح لطبقات أعمق أن يلاحظ7، وتوفير التصوير 3D فريدة من نوعها. يستخدم الآن المجهر متعدد الفوتون في تصوير الأعصاب القحفية8 وتم توسيعه ليشمل دراسة ديناميات الخلايا العصبية في الفئران الحية9و10و11.
في هذه التجربة ، بعد وضع علامات فلورية للأوعية الدموية الماوس ، يتم إصلاح الكبد في إطار ، ويمكن رؤية ديناميات الأوعية الدموية في أنسجة الكبد الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتون. توضح هذه التجربة كيفية وضع علامة على مواد محددة ، واستخدام المجهر متعدد الفوتون للمساعدة في مراقبة موقع داخل الأنسجة ، ومراقبة الأحداث الخلوية في الأنسجة بين الخلايا ، وإجراءقياسات ضوئية 12،13،14، ومراقبة الديناميكيات المادية داخل الأنسجة الحية15. على سبيل المثال، تم تحديد علامة بطانة الورم 1 (TEM1) كعلامة سطح جديدة أعلى تنظيما على الأوعية الدموية والستروما في العديد من الأورام الصلبة، ووضع علامة على جزء متغير من سلسلة واحدة (scFv) 78 ضد TEM1، ومن ثم يمكن استخدام المجهر متعدد الفوتون لموقع ورم وعائي الماوس وتقييم الأورام16.
Protocol
Representative Results
Discussion
مراقبة نسيج حي معين هو وسيلة فعالة لفهم التغيرات والتوطين والآثار البيولوجية للمواد داخل الأنسجة17. في هذه التجربة ، والخطوات الهامة هي تحديد الكبد مع لاعبا اساسيا تصوير الجهاز ، والتي يمكن أن تحل مشكلة القطع الأثرية الحركة بسبب التنفس وضربات القلب ، واستخدام المجهر متعددةفو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772133، 81902444)، وصندوق غوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2020A1515010269، 2020A1515011367)، ومشروع بحوث العلوم والتكنولوجيا الصحية للمواطنين في قوانغتشو (201803010034، 201903010072)، ومشروع الابتكار الطبي العسكري (17CXZ008).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Riferimenti
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
