Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen
Summary
In dit experiment wordt een muis in zijn staartader geïnjecteerd met Rhodamine B isothiocyanaat-dextran die bloedvaten kan bevlekken. Nadat de lever is blootgesteld en gefixeerd, kan een specifiek deel van de lever worden geselecteerd om het diepe weefsel in het levende lichaam te observeren met behulp van multifotonenmicroscopie.
Abstract
Het observeren van de intravasculaire dynamiek van leverweefsel van muizen stelt ons in staat om verdere diepgaande observaties en studies uit te voeren naar weefselgerelateerde ziekten van de muizenlever. Een muis wordt geïnjecteerd met een kleurstof die bloedvaten kan bevlekken. Om de muizenlever in vivo te observeren, wordt deze blootgesteld en in een frame bevestigd. Twee- en driedimensionale beelden van de bloedvaten in het leverweefsel worden verkregen met behulp van een multifotonenmicroscoop. Beelden van de weefsels op de geselecteerde locaties worden continu verkregen om veranderingen op lange termijn waar te nemen; de dynamische veranderingen van bloedvaten in de leverweefsels worden ook waargenomen. Multifotonenmicroscopie is een methode voor het observeren van cel- en celfunctie in diepe weefselsecties of organen. Multifotonenmicroscopie heeft gevoeligheid voor weefselmicrostructuur en maakt beeldvorming van biologische weefsels met een hoge ruimtelijke resolutie in vivo mogelijk, waardoor de biochemische informatie van de organisatie kan worden vastgelegd. Multifotonenmicroscopie wordt gebruikt om een deel van de lever te observeren, maar het fixeren van de lever om het beeld stabieler te maken is problematisch. In dit experiment wordt een speciale vacuümzuignap gebruikt om de lever te fixeren en een stabieler beeld van de lever onder de microscoop te verkrijgen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om dynamische veranderingen van specifieke stoffen in de lever waar te nemen door dergelijke stoffen met kleurstoffen te markeren.
Introduction
Bloedvaten kunnen voedingsstoffen leveren voor verschillende orgaanweefsels van het menselijk lichaam en stoffen uitwisselen. Tegelijkertijd functioneren veel cytokinen, hormonen, medicijnen en cellen ook via vasculair transport naar specifieke locaties. Het observeren van vasculaire veranderingen in leverweefsel kan helpen bij het begrijpen van de verdeling van de bloedstroom in leverweefsel en het transport van stoffen, en helpen bij de analyse van bepaalde vasculaire gerelateerde ziekten1,2.
Er zijn veel manieren om de bloedvaten van de lever bij muizen te observeren. Onder hen heeft optische microscopie veel beperkingen bij het observeren van ondoorzichtig vasculair weefsel3. Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om de bloedvaten van levende levers met niet-invasieve hoge resolutie 4 in beeld tebrengen. Niet alleen kunnen driedimensionale beelden van bloedvaten worden verkregen, maar de techniek kan ook worden gebruikt om het weefsel te helpen organiseren om biologische effecten daarin te observeren; bovendien kan het hele weefsel worden afgebeeld in plaats van alleen de microvessels zoals in computertomografie en magnetische resonantiebeeldvorming5.
Multifotonenmicroscopie kan worden gebruikt om verspreide fluorescerende signalen in diep levend weefsel effectief te detecteren, met minder fototoxiciteit6. Daarom kan de activiteit van levend weefsel worden gegarandeerd en kan de hoeveelheid schade worden verminderd. Multifotonenmicroscopie heeft een beter doordringend vermogen dan confocale microscopie, waardoor diepere lagen kunnen worden waargenomen7,wat unieke 3D-beeldvorming biedt. Multifotonenmicroscopie wordt nu vaak gebruikt bij beeldvorming van hersenzenuwen8 en is uitgebreid tot de studie van neuronale dynamica bij levende muizen9,10,11.
In dit experiment, na fluorescerende etikettering van muisbloedvaten, wordt de lever in een frame gefixeerd en is de dynamiek van bloedvaten in levend leverweefsel te zien met behulp van multifotonenmicroscopie. Dit experiment demonstreert hoe specifieke stoffen te markeren, multifotonenmicroscopie te gebruiken om een locatie in het weefsel te observeren, cellulaire gebeurtenissen in het intercellulaire weefsel te observeren, fotochemische metingen te doen12,13,14en de materiaaldynamiek in het levende weefsel te observeren15. Tumor endotheelmarker 1 (TEM1) is bijvoorbeeld geïdentificeerd als een nieuwe oppervlaktemarker die op de bloedvaten en stroma in veel solide tumoren wordt gereguleerd, waardoor eenketenig variabel fragment (scFv) 78 tegen TEM1 wordt gemarkeerd, en vervolgens kan multifotonenmicroscopie worden gebruikt voor de locatie van muis hemangioom en evaluatie van tumoren16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het observeren van een specifiek levend weefsel is een effectief middel om de veranderingen, lokalisatie en biologische effecten van het materiaal in het weefsel te begrijpen17. In dit experiment zijn de belangrijke stappen het fixeren van de lever met een orgaanbeeldvormingsarmatuur, dat het probleem van bewegingsartefacten als gevolg van ademhaling en hartslagen kan oplossen, en het gebruik van een multifotonmicroscoop voor observatie. Met behulp van deze methode worden de interne weefsels van d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81772133, 81902444), het Guangdong Natural Science Fund (2020A1515010269, 2020A1515011367), het Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034, 2019030107).
Materials
| 1 mL syringe x 2 | Hunan Pinan Medical Devices Technology | YA0551 | |
| 5 W heating pad | BiolinkOptics Technology | BL336 | |
| 75% absolute ethanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1.17113.023 | |
| Absorbent cotton ball | Healthy Sanitation Kingdom | ||
| Mouse surgical instrument | RWD Life Science | SP0001-G | Including scissors and tweezers |
| Multiphoton microscopy | Olympus | FV1200MPE | |
| Organ imaging fixture | BiolinkOptics Technology | BL336 | Including suction cup, hose, negative pressure pump and bracket |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma | R9379 | |
| Shaving machine | Lei Wa | RE-3201 | |
| Sodium pentobarbital | Sigma | P3761-25G |
Riferimenti
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410 (2019).
- Werkmeister, E., et al. Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77 (2007).
- Wang, H., et al. Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine. Biomed Research International. 2015, 783983 (2015).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Vogt, N. Chromatic multiphoton imaging of the whole brain. Nature Methods. 16 (6), 459 (2019).
- Bacskai, B. J., et al. Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy. Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Liu, H., et al. In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots. Nano Letters. , (2019).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology. Methods. 128, 20-32 (2017).
- Shear, J. B. Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry. Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Yuan, X., et al. Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy. Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).
- Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Multiphoton microscopy in biological research. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).
