Veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol voor veldidentificatie van Matricaria chamomilla met behulp van een draagbaar qPCR-systeem. Dit eenvoudig uit te voeren protocol is ideaal als methode om de identiteit van een botanische soort te bevestigen op locaties waar de toegang tot laboratoriumapparatuur en expertise beperkt is, zoals boerderijen en magazijnen.

Abstract

Kwaliteitscontrole in botanische producten begint met de grondstoffenvoorziening. Traditioneel, botanische identificatie wordt uitgevoerd door middel van morfologische beoordeling en chemische analytische methoden. Het gebrek aan beschikbaarheid van botanici, vooral in de afgelopen jaren, in combinatie met de noodzaak om de kwaliteitscontrole te verbeteren om de spanningen in de toeleveringsketen als gevolg van de toenemende vraag van de consument en de klimaatverandering te bestrijden, vereist echter alternatieve benaderingen. Het doel van dit protocol is om de identificatie van botanische soorten te vergemakkelijken met behulp van een draagbaar qPCR-systeem op het veld of in welke omgeving dan ook, waar de toegang tot laboratoriumapparatuur en expertise beperkt is. Doel-DNA wordt versterkt met behulp van kleurstof-gebaseerde qPCR, met DNA geëxtraheerd uit botanische referentiematerialen die dienen als een positieve controle. Het doel-DNA wordt geïdentificeerd door zijn specifieke versterking en het afstemmen van de smeltpiek tegen de positieve controle. Een gedetailleerde beschrijving van de stappen en parameters, van hands-on veld monster verzameling, dna-extractie, PCR versterking, gevolgd door interpretatie van gegevens, is opgenomen om ervoor te zorgen dat lezers dit protocol kunnen repliceren. De geproduceerde resultaten komen overeen met de traditionele botanische identificatiemethoden voor het laboratorium. Het protocol is eenvoudig uit te voeren en kosteneffectief, waardoor kwaliteitstests op grondstoffen zo dicht mogelijk bij het punt van oorsprong van de supply chain mogelijk te maken.

Introduction

De praktijk van het gebruik van plantaardige producten te handhaven en te verbeteren gezondheid dateert uit duizenden jaren. Als gevolg van spanningen in de toeleveringsketen als gevolg van de toegenomen vraag van de consument¹, niet-duurzame oogstpraktijken en klimaatverandering², wordt botanische vervalsing een groeiende zorg in de voedings- en voedingssupplementindustrie³. De aanwezigheid van niet-aangegeven of verkeerd geïdentificeerde botanische soorten kan leiden tot verminderde werkzaamheid, of zelfs veiligheidsproblemen. Bijvoorbeeld, zwarte cohosh (Actaea racemosa), gebruikt voor de behandeling van premenstrueel ongemak, kan worden vervangen door een goedkope Aziatische soort met beperkte klinische gegevens ondersteuning voor de werkzaamheid^{ervan 4}. In een ernstiger geval, substitutie van Aristolochia fangchi voor Stephania terandra in een klinische studie voor gewichtsverlies met behulp van Chinese kruiden leidde tot ernstige nefrotoxiciteit en nierfalen bij sommige deelnemers^5,6. De twee verschillende soorten deelden een Chinese gemeenschappelijke naam “Fang Ji”. In deze gevallen wordt gewezen op de noodzaak van strengere kwaliteitscontrole, te beginnen met de identificatie van grondstoffen⁷, bij voorkeur zo dicht mogelijk bij het punt van oorsprong van de toeleveringsketen, zodat middelen efficiënt kunnen worden toegewezen aan het materiaal van de juiste identiteit.

Een aantal orthogonale benaderingen kan worden gebruikt voor botanische identificatie. Traditioneel wordt botanische identificatie uitgevoerd door middel van morfologische beoordeling^8,9 en chemische analysemethoden^10,11,12,13. Morfologische identificatie is gebaseerd op verschillen in macroscopische en microscopische kenmerken van plantaardige materialen als er verschillen bestaan (figuur 1). Echter, het gebrek aan trainingsprogramma’s op klassieke plantkunde in de afgelopen jaren heeft geresulteerd in een tekort aan deskundigen¹⁴, waardoor deze aanpak onpraktisch voor routine kwaliteitscontrole. De toepassing ervan in botanische poedervormige materialen is ook beperkt. Chemische analysemethoden worden veel gebruikt in farmacopee en laboratoria, maar zijn niet ideaal voor veldtesten vanwege de grootte van instrumenten zoals High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) en Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy(FIGUUR 2)en milieuvereisten. Genomic methoden zijn onlangs naar voren gekomen als een alternatieve techniek voor de authenticatie en substitutiedetectie van botanische soorten en heeft bewezen efficiënt en nauwkeurig te zijn. Genomische methoden maken gebruik van de hoge getrouwheid en specificiteit van genetische informatie in plantaardige materialen^{15,16,17,18,19}. Moleculaire diagnostische instrumenten zijn beschikbaar in de vorm van draagbare apparaten, en bevatten vaak geautomatiseerde data-interpretatie tools die de barrière voor het gebruik van technologie verlagen, waardoor deze aanpak ideaal is voor veldidentificatie^{20,21,22,23,24}. Zodra de moleculaire analysemethode is ontworpen en gevalideerd^25,26,27, kan het worden uitgevoerd door elk personeel met een basisopleiding moleculaire biologie. Onder de verschillende draagbare tools beschikbaar, real-time PCR op DNA-sequenties is een van de kosteneffectieve keuzes²⁸. De combinatie van een draagbaar apparaat, samen met aangepaste en gevalideerde moleculaire analyse, maakt verificatie van botanische soorten en ingrediënten buiten het laboratorium mogelijk, zoals in boerderijen en botanische materiaalmagazijnen, waardoor de tijd en kosten in verband met traditionele methoden worden verminderd.

Het doel van dit protocol is om een methode voor botanische identificatie in te voeren in situaties waarin de toegang tot laboratoriumapparatuur en expertise beperkt of niet beschikbaar is, met behulp van een draagbaar qPCR-systeem. De methode wordt gedemonstreerd op een veld van Matricaria chamomilla (figuur 3A), algemeen bekend als Duitse kamille, op grote schaal gebruikt voor zijn ontstekingsremmende en antioxidant eigenschappen²⁹. Het kan worden verward met verwante soorten van vergelijkbare verschijning of geur, vooral van de geslachten Chamaemelum, Tanacetum, en Chrysant^30,31,32. Onder de verwante soorten is Chamaemelum nobile, ook bekend als Romeinse kamille, een merkbare met vergelijkbare productieniveaus in de handel (figuur 3B). De aangetoonde methode was ontworpen om niet alleen de beoogde botanische soort M. chamomillate identificeren, maar ook zijn naaste verwante, C. nobile, op basis van specifieke versterking van DNA-sequenties.

Dit artikel legt in detail uit hoe u botanische identificatie van M. chamomilla uitvoeren met behulp van intercalating dye-based qPCR en melt curve analyse op een draagbaar apparaat. Het protocol omvat het verzamelen van botanische monsters uit het veld, on-site DNA-extractie, en het opzetten van real-time PCR-reactie. Om een geldige conclusie te garanderen, worden doel botanische M. chamomilla en niet-doel botanische C. nobile genomic DNA, vooraf geëxtraheerd uit gecertificeerde botanische referentiematerialen, gebruikt als positieve controle. De specificiteit van deze methode wordt aangetoond door zowel M. chamomilla- als C. nobile-identificatietests individueel uit te voeren op monsters en controles. Niet-sjabloonnegatieve controle wordt gebruikt om fout-positieve resultaten veroorzaakt door PCR-verontreiniging uit te sluiten.

Protocol

1. Monsterverzameling Stel een testgebied in het veld in met een vlak en horizontaal oppervlak. Identificeer een representatieve plant die de kenmerken van de meeste planten in het kamillebloemveld weerspiegelt (figuur 4). Kies een bloemkop van de representatieve plant met behulp van steriele handschoenen. Plaats het monster in een opvangbuis van 2,0 mL. Herhaal de stappen 1,3 tot 1,4 en verzamel een bijsluiter (ongeveer 0,5–0,7 cm lang) van dezelfde plant.LET OP: M. chamomilla bloem en blad zijn klein genoeg om te zitten aan de onderkant van een 2,0 mL collectie buis. Voor andere plantaardige producten met een groter oppervlak kan een papieren stoot of schaar (voor gebruik in 70% ethanol gespoeld) worden gebruikt om weefselmonsters te isoleren voor het testen. Wanneer meerdere bemonstering nodig is, spoel de papierpunch of schaar tussen de behandeling van verschillende monsters. 2. DNA-extractie Verwarm de droge badkubuse voor op 95 °C. Voeg aan elke verzamelbuis 100 μL van de extractieoplossing toe uit de DNA-extractiekit van de installatie (vermeld in Tabel van Materialen). Voor een betere DNA-extractie-efficiëntie, maal het weefselmonster in de extractieoplossing met behulp van een weefselplagen. Sluit de buis. Zorg ervoor dat het botanische weefsel tijdens het extractieproces met de extractieoplossing wordt bedekt. Plaats de opvangbuizen in een voorverwarmde droogbadcub en broed de opvangbuizen gedurende 10 minuten op 95 °C. Na 10 minuten, neem de buizen uit de droge bad incubator. Voeg 100 μL van de verdunningsoplossing uit dezelfde DNA-extractiekit toe en meng de oplossing door meerdere keren op en neer te pipetten. Herhaal dezelfde stap voor folderextractie. Schud om de oplossing verder te mengen. Het plantenweefsel lijkt meestal niet te worden afgebroken na deze behandeling. De vloeibare kleur kan veranderen en troebel worden.LET OP: De verdunde oplossing kan ‘s nachts bij kamertemperatuur worden opgeslagen als deze niet onmiddellijk verloopt. Het is niet nodig om het cellulaire puin te verwijderen uit plantweefsel voor opslag. De vloeistof in de buizen bevat de DNA-sjablonen voor downstream PCR-versterking. 3. PCR-reactie-setup Configureer de thermocyclingvoorwaarden van het qPCR-instrument volgens de specificaties van de fabrikant. Breng het pcr-thermocyclingprofiel aan in (Tabel 1), dat begint met een constante temperatuurstap voor de eerste denaturatie, gevolgd door 25 cycli van versterking, en eindigt met temperatuurhellingen om een smeltcurve met hoge resolutie te verkrijgen. Ontdooi de qPCR Master Mix en primers(tabel 2) bij kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik. Plan de reactie die in elke put zal worden geladen: putten met positieve controle met doelsoorten, positieve controle met niet-doelsoorten, monsters en negatieve controle (figuur 5). In dit voorbeeld worden tien putten gebruikt – vijf voor de Duitse kamille-identificatietest en de overige vijf voor de Romeinse kamille-identificatietest. Voor elk type soortidentificatietest bevat één put positieve controle met DNA dat uit het referentiemateriaal van de beoogde soort wordt gewonnen, één put bevat positieve controle met DNA dat wordt gewonnen uit referentiemateriaal van niet-gerichte soorten, twee putten zijn gevuld met bloem- en blad-DNA-monsters die uit het veld worden geëxtraheerd en één put wordt toegewezen voor een negatieve controle. Tabel 3 beschrijft elk goed type. Bereid een reactie master-mix volgens de handleiding voor elke botanische soort identificatie test. Een typische reactiemaster-mix bevat universele qPCR Master Mix (2x), voorwaartse en omgekeerde soortenspecifieke primers en nuclease-vrij water. Tabel 4 bevat de samenstelling van het reactiesysteem.LET OP: Bewaar de qPCR-reactiemastermix niet onmiddellijk op +2 °C tot +8 °C in een koeler of minikoelkast. Meng de reactiemaster-mix grondig door voor gebruik te pipetten. Plaats de qPCR cartridge face-up op een plat en stabiel oppervlak. Laad 18 μL van de reactiemaster-mix geconfigureerd in stap 3.4 in de cartridgeputs volgens de putten gedefinieerd in stap 3.3. Voeg voor deze demonstratie de Duitse kamille-testreactie-testmix toe in putten die zijn gelabeld voor GC-test (GCT in putten 1, 3, 5, 7, 9) en de Romeinse kamille-identificatietestreactiemaster-mix in putten die zijn gelabeld voor RC-test (RCT in putten 2, 4, 6, 8, 10) (zie figuur 5). Breng 2 μL monster-DNA over van de supernatant van DNA-extractiebuizen en vooraf geëxtraheerde DNA-positieve controles in cartridgeputs die vooraf zijn geladen met qPCR-mastermix. Nadat u elke DNA-sjabloon aan de qPCR-mastermix hebt toegevoegd, mengt u de oplossing voorzichtig door pipetting.OPMERKING: Vermijd drijvend cellulair puin bij het overbrengen van DNA uit de DNA-extractiebuis. Gebruik minicentrifuge om de supernatant en cellulaire puin te scheiden, indien nodig. Sluit de cartridge voorzichtig af met plakfolie. Laad de cartridge op de thermocyclingkamer en sluit deze. Stel het qPCR-instrument in om uit te voeren.

Representative Results

Volgens het in punt 1 beschreven protocol werd botanisch DNA van bloemkop en blad in de supernatant gehaald na warmteincubatie van de opvangbuis bij 95 °C gedurende 10 minuten. In de huidige studie, de supernatant toonde een gele en groenachtige kleur voor zowel bloem en blad, wat aangeeft dat een verscheidenheid van natuurlijke verbindingen werden vrijgegeven in de supernatant met botanische DNA (Figuur 6). Hoewel betrouwbare PCR-versterking later werd bereikt in drievoud voor alle veld geëxtraheerd DNA-sjabloon, DNA-kwaliteit beoordeling werd uitgevoerd in het laboratorium als referentie. De concentratie van het DNA-extract van de bloemkop, bepaald door fluorometrie, varieerde van 3,69-5,36 ng/μL, terwijl de concentratie van het DNA-extract van het blad varieerde van 6,42–9,29 ng/μL. De A260/A280 en A260/A230 absorptieratio’s van bloem- en blad-DNA-extracten werden gemeten aan de spectrofotometrie. Vanwege de overlap tussen DNA en fytochemisch UV-absorptiespectrum konden deze verhoudingen echter niet worden gemeten op betrouwbaarheid (gegevens die niet worden weergegeven). Intercalating fluorescerende kleurstof werd gebruikt om de versterking van doelfragmenten in real-time te controleren. Aangezien zowel de specifieke primers M. chamomilla als C. nobile zich richten op het interne getranscribeerde spacer 2 (ITS2) gebied, dat tientallen tot honderden kopieën in het plantengenoom heeft, zijn 25 PCR-versterkingscycli voldoende om voldoende amplicons te genereren voor de identificatie van kamillesoorten. In figuur 7was de Ct-waarde voor M. chamomilla-positieve controle bij M. chamomilla-identificatietest minder dan 25 (GCP_GCT), terwijl na 25 versterkingscycli de fluorescentie van dezelfde controle in C. nobile-identificatietest onder de detectiedrempel lag (GCP_RCT). Aan de andere kant lag de fluorescentie voor C. nobile positive control in M. chamomilla-identificatietest na 25 cycli onder de detectiedrempel (RCP_GCT), terwijl de Ct-waarde voor dezelfde controle in C. nobile-identificatietest minder dan 25 (RCP_RCT) bedroeg. De versterking van doel- en niet-doelpositieve controles in hun respectieve tests toont de specificiteit aan van de M. chamomilla-identificatietest. Voor monster-DNA leverden het veldbloemenkop en het DNA-extract van de veldbloem ct-waarden van respectievelijk 15,18 en 19,41 op bij de identificatietest van M. chamomilla (Monster1(FLOWER)_GCT en Sample2(LEAF)_GCT). Beide monsters werden niet versterkt in C. nobile-identificatietest (Sample1(FLOWER)_RCT en Sample2(LEAF)_RCT). De versterkingspatronen van beide monsters kwamen overeen met het versterkingspatroon van M. chamomilla positieve controle. Zowel bij de identificatietests van M. chamomilla als in de C. nobile-identificatie (NC_GCT en NC_RCT) werden geen negatieve controles versterkt, met uitzondering van de mogelijkheid van fout-positieven als gevolg van PCR-besmetting. Om de specifieke versterking in positieve controles en monsters verder te bevestigen, werden fracties van PCR-eindproduct van elke put uitgevoerd op 2% agarose gel in het laboratorium(figuur 8). Voor M. chamomilla-identificatietest leverden beide veldmonsters amplicons op die op dezelfde positie liepen als de M. chamomilla-positieve controle met een geschatte grootte iets boven 100 bp (theoretische maat 102 bp). Voor C. nobile-identificatietest leverde niet-doelsoort C. nobile positieve controle een band op tussen 50 en 100 bp, passend bij de theoretische grootte van 65 bp. De rest van de rijstroken toonde geen specifiek versterkingsproduct, dat in overeenstemming was met de afwezigheid van fluorescerend signaal voor deze putten, zoals waargenomen in veldtesten. Na PCR-versterking werd een smeltcurveanalyse uitgevoerd om de dissociatiekenmerken van dubbelstrengs DNA (dsDNA) tijdens het verwarmen te beoordelen. Toen de temperatuur tijdens de laatste cyclus voor de analyse van de smeltcurve steeg, zorgde de temperatuurstijging ervoor dat de dubbelstrengamplicons zich loskoppelden. De intercalating fluorescerende kleurstof werd geleidelijk vrijgegeven in de oplossing, afnemende fluorescentie intensiteit(Figuur 9A). Het buigpunt van de eerste afgeleide curve werd gebruikt om de smelttemperatuur (Tm)(figuur 9B)te bepalen, die voornamelijk afhankelijk is van de lengte van het DNA-fragment en het GC-gehalte. Het combineren van Ct-waarde met smelttemperatuur kan de specificiteit van qPCR-analyse verhogen. In de huidige studie, de smelttemperatuur piek van M. chamomilla positieve controle PCR amplicon vond plaats bij 85,6 °C (GCP_GCT) en het was onderscheiden van de smelttemperatuur piek van C. nobile positieve controle PCR amplicon op 79,1 °C (RCP_RCT). De PCR amplicon van veldbloemkop en blad produceerde smelttemperatuurpieken bij respectievelijk 85,2 °C en 84,8 °C (Sample1(FLOWER)_GCT en Sample2(LEAF)_GCT). Om smelttemperatuurschommelingen te beoordelen, gemeten door het draagbare qPCR-systeem, werden aanvullende gegevenspunten verzameld om te bevestigen dat de smelttemperaturen van de monsters altijd dicht bij de smelttemperatuur lagen die werd verkregen uit M. chamomilla-positieve controle (binnen 2 °C) en ver verwijderd waren van de smelttemperatuur van C. nobile positieve controleamplyl (figuur 10). Smeltende temperatuurpieken werden soms gemeld in andere putten. Hun Ct-waarden waren echter niet minder dan 25 en de smelttemperatuurpieken lagen niet in de buurt van M. chamomilla of C. nobile positieve controle (meer dan 2 °C uit elkaar). Samengevat kan de identificatietest van veld M. chamomilla worden geïnterpreteerd op basis van beslissingsregels samengevat in tabel 5. Met alle positieve controles testen positief voor de vermeende botanische soorten, negatief voor de andere soorten, en negatieve controles testen negatief, beide veld monsters werden bepaald om M. chamomilla bevatten, maar niet C. nobile. Bovendien werden veldconclusies, om veldtestresultaten af te stemmen op andere analytische technieken, verder bevestigd door een eerder gevalideerde DNA-barcodingmethode25 (niet getoonde gegevens). Figuur 1: Morfologische identificatie van botanische materialen. (A) Hibiscus rosa-sinensis bloemen, Curcuma longa wortels, Malva Sylvestris bladeren, Rosmarinus officinalis bladeren, Coriandrum sativum zaden, Zingiber officinale wortels. (B) Petroselinum crispum en Apium graveolens vlokken zijn moeilijk te onderscheiden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Chemische identificatie van botanische materialen. aA) HPTLC-instrument en een representatief HPTLC-chromatogram. bB) HPLC-instrument en een representatief HPLC-chromatogram. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Matricaria chamomilla en Chamaemelum nobile in het veld. (A) Matricaria chamomilla, aangepast van Wikipedia onder CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, aangepast van Wikipedia onder CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Het verzamelen van M. chamomilla plantendelen uit het veld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Lay-out van testputten in de demonstratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 6: Veld-DNA-extract in verzamelingsbuizen. Botanisch weefsel blijft in de originele buis en is bedekt met geelachtige DNA-extract. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 7: Fluorescentie plot met de accumulatie van PCR-producten over 25 cycli van thermocycling. M. chamomilla positieve controle en C. nobile positieve controle tonen Ct waarden minder dan 25 in M. chamomilla en C. nobile identificatie tests, respectievelijk. De veldbloem- en bladmonsters werden versterkt door M. chamomilla-identificatietest met Ct-waarden van 15,18 en 19.41. De rest van de putten werden niet versterkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 8: Gel elektroforese van veld-PCR-versterkingsproducten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 9: Smeltende temperatuuranalyse. (A) Het fluorescentiesignaal in elke put neemt af met de stijgende temperatuur. (B) De identiteit van de PCR-producten werd bevestigd door de smelttemperatuurpiek in de analyse van de smeltcurve. De veldbloem- en bladmonsters vertonen pieken bij 85,2 °C en 84,8 °C. Deze zijn dicht bij de piek geproduceerd door M. chamomilla positieve controle. De C. nobile positieve controle produceerde een piek bij 79.1 °C, die verschilt van de andere drie monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 10: Smelttemperatuur piekvariatie tussen positieve controle en veldmonsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Fase Cyclus Temperatuur Tijd Constante temperatuur 1 95 °C 60s Versterking 25 95 °C 30s 60 °C 30s Smeltcurve 1 60 °C Helling 0,05 °C/s 95 °C Tabel 1: qPCR thermocycling voorwaarden voor M. chamomilla en C. nobile identificatietests. Test Naam primer Volgorde 5′-3′ Positie Regio Amplicongrootte Matricaria recutita ZL3 ZL3 TCGTCGGTCGCAAGGATAAG Doorsturen ITS2 102 bp ZL4 ZL4 TAAACTCAGCGGGTAGTCCC Omgekeerde Chamaemelum nobile ZL11 ZL11 TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA Doorsturen ITS2 65 basispunten ZL12 ZL12 TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC Omgekeerde Tabel 2: Primerpars voor M. chamomilla en C. nobile identificatietests. Goed positie Nou naam Beschrijving 1 GC_PosCtrl_GC_Test Duitse kamille positieve controle onder GC Test 2 GC_PosCtrl_RC_Test Duitse kamille positieve controle onder RC Test 3 RC_PosCtrl_GC_Test Romeinse kamille positieve controle onder GC Test 4 RC_PosCtrl_RC_Test Romeinse kamille positieve controle onder RC Test 5 Field_Sample_GC_Test Monster van bladweefsel in het kader van GC-test 6 Field_Sample_RC_Test Monster van bladweefsel onder RC Test 7 Field_Sample_GC_Test Monster van bloemweefsel in het kader van GC-test 8 Field_Sample_RC_Test Monster van bloemweefsel onder RC Test 9 NegCtrl_GC_Test Negatief controlemonster onder GC-test 10 NegCtrl_RC_Test Negatief controlemonster onder RC-test Tabel 3: Nou types en beschrijvingen voor M. chamomilla en C. nobile identificatietests. Reagens GC_Test RC_Test Universele qPCR-mix* 10 μL 10 μL ZL3 primer (10 μM) 0,4 μL NA ZL4 primer (10 μM) 0,4 μL NA ZL11 primer (10 μM) NA 0,4 μL ZL12 primer (10 μM) NA 0,4 μL H2O (Nuclease-vrij) 7,2 μL 7,2 μL * bevat Hot Start Taq DNA Polymerase Tabel 4: Master-mix samenstelling voor M. chamomilla en C. nobile identificatietests. Nou Naam Verwacht resultaat Criteria voor positief resultaat Criteria voor negatief resultaat Gedetecteerd / Aanwezig Niet gedetecteerd / Afwezig GC_PosCtrl_GC_Test Gedetecteerd Ct < 25 en 84 <= Tm <= 86 – GC_PosCtrl_RC_Test Niet gedetecteerd – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli RC_PosCtrl_GC_Test Niet gedetecteerd – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli RC_PosCtrl_RC_Test Gedetecteerd Ct < 25 en 79 <= Tm <= 81 – Field_Sample_Leaf_GC_Test Aanwezig Ct < 25 en 84 <= Tm <= 86 Geen Ct-waarde binnen 25 cycli Field_Sample_Leaf_RC_Test Afwezig – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli Field_Sample_Flower_GC_Test Aanwezig Ct < 25 en 84 <= Tm <= 86 Geen Ct-waarde binnen 25 cycli Field_Sample_Flower_RC_Test Afwezig – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli NegCtrl_GC_Test Niet gedetecteerd – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli NegCtrl_RC_Test Niet gedetecteerd – Geen Ct-waarde binnen 25 cycli Tabel 5: Regels voor de interpretatie van qPCR-resultaten.

Discussion

Het ontwerp van primers en template selectie zijn de cruciale stappen in het verkrijgen van een efficiënte en specifieke qPCR versterking. Na het identificeren van een geschikte sjabloon wordt primerontwerpsoftware meestal gebruikt om de selectie van primers te helpen op basis van ontwerpvariabelen zoals primerlengte, smelttemperatuur en GC-inhoud^33,34. Optimalisatie en validatie kan worden uitgevoerd onder de verwachte experimentele omstandigheden van de test om specificiteit, gevoeligheid en robuustheid van een PCR-reactie³⁵te garanderen. Suboptimale primer ontwerp kan resulteren in primer-dimer vorming, waarin primer interacties produceren niet-specifieke producten³⁶.

De no template controls (NTC) die in deze studie worden gebruikt, controleren op zowel DNA-besmetting als de aanwezigheid van primer-dimers die de test kunnen beïnvloeden. De resultaten toonden geen versterking, een goede indicatie dat zowel DNA-besmetting als primer-dimers geen probleem zijn. DNA-verontreiniging en primer-dimers manifesteren zich in smeltcurven zonder sjablooncontroles en als extra pieken in smeltcurven van positieve controles. Doorgaans wordt verwacht dat de smeltcurve van een positieve controle één piek bevat, tenzij AT-rijke subdomeinen in de sjabloon ongelijke smelten veroorzaken. Dubbele pieken kunnen worden voorspeld door het simuleren van smeltende testen met behulp van de uMELT software³⁷. In deze studie werd de gouden standaard van het uitvoeren van het PCR-product op agarose gel gebruikt om de aanwezigheid van doel-PCR-product en afwezigheid van verontreiniging en primer-dimers te bevestigen.

Een aanzienlijke uitdaging in botanische materiaal moleculaire analyse is het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardig DNA na het botanische DNA-extractieproces. Botanische materialen worden verhandeld en geconsumeerd voor de actieve chemische verbindingen die worden geassocieerd met voordelen voor de gezondheid. Tijdens de DNA-extractie zullen deze chemische verbindingen ook worden vrijgegeven in de DNA-extractieoplossing, wat mogelijk PCR-remming veroorzaakt, wat resulteert in storingen in PCR-versterking. Verschillende plantaardige DNA zuivering kits met behulp van organische oplosmiddelen en kolommen zijn ontwikkeld om chemische verbindingen afgeleid van plantaardige³⁸te verwijderen. Echter, rookkap en high-speed centrifuge nodig om deze kits te helpen zijn niet beschikbaar in het veld.

In het huidige protocol maakt de vereenvoudigde DNA-extractiemethode gebruik van een commerciële dna-extractiekit voor planten (zie Tabel van Materialen voor meer informatie). Het had de mogelijkheid om gemeenschappelijke remmende stoffen te neutraliseren voor reproduceerbare resultaten en produceerde consistente resultaten voor M. chamomilla en C. nobile. Zowel M. chamomilla als C. nobile bloemkoppen en bladeren leverden PCR-amplicons op met specifieke smeltpieken, wat aangeeft dat de aanwezigheid van PCR-remmers geen probleem was. Voor andere planten met hogere niveaus van PCR-remmers kan het versterken van DNA in hun oorspronkelijke extractie minder efficiënt zijn. Om de remming te verminderen en de versterkingsefficiëntie te verbeteren, kunnen met toegang tot de hele installatie ook andere plantendelen met een lager polysaccharide- en polyfenolgehalte voor identificatiedoeleinden worden gebruikt. Als er beperkte toegang tot verschillende plantendelen, jongere bladeren of bloemblaadjes ontleed uit bloemkoppen, die meestal lagere fenolgehalte³⁹hebben, kan een betere kans op succes bieden. Aangezien DNA-sequenties consistent zijn over de hele plant, kan elk plantdeel worden gebruikt om de identiteit van soorten te bevestigen. Als PCR-versterking nog steeds suboptimaal is, kan het oorspronkelijke DNA-extract verder worden verdund voordat PCR, of meer geavanceerde laboratoriumzuiveringsprotocollen kunnen worden gebruikt.

Een andere uitdaging voor PCR-analyse is vals-positieve resultaten veroorzaakt door DNA-besmetting, die een negatieve invloed kunnen hebben op de interpretatie van gegevens. Het wordt meestal gecontroleerd door actieve huishouding, met behulp van speciale apparatuur, en het beperken van het werk tot aangewezen gebieden. Met behulp van qPCR kan alle PCR-analyse worden uitgevoerd in een gesloten systeem, wat de kans op PCR-ampliconbesmetting in een omgeving die niet goed wordt gecontroleerd, sterk vermindert. Bovendien moet milieu-DNA ook geen vals-positief laten zien vanwege de specificiteit van de test, volgens een eerdere validatiestudie⁴⁰.

Er is ruimte voor verbetering. In het hier gepresenteerde protocol werd intercalating dye gebruikt om doelfragmentversterking in real-time te tonen. De specificiteit van de methode wordt verder bevestigd door de karakteristieke smelttemperatuur, die zich onderscheidt tussen M. chamomilla en C. nobile amplicons. Daarom kan intercalating dye-based PCR efficiënt antwoord geven op de vraag “Wat is deze plantensoort?” in het veld. Naast de noodzaak van botanische identificatie op een enkele plant geïsoleerd van het veld, zullen in veel omstandigheden botanische poeders of extracten in het magazijn echter ook profiteren van een snelle identiteitsbeoordeling ter plaatse. Voor dit soort materialen moeten mogelijk aanvullende vragen worden beantwoord, zoals “Wat zit er in dit materiaal?”, “Bevat het de botanische soorten die ik zoek?”, “Bevat het overspeligen die ik wil vermijden?”, en “Wordt het geheel of gedeeltelijk vervangen door andere botanische soorten die schadelijk zijn?”. In plaats van het gebruik van intercalating kleurstof, verschillende qPCR sondes kunnen worden ontworpen om amplicons richten van verschillende plantaardige producten in een reactie systeem, met behoud van hoge specificiteit en efficiëntie van de test. Ontwikkeling van op sonde gebaseerde qPCR en het gebruik van een draagbaar qPCR-systeem dat detectie met meerdere kanalen biedt, kan de toepassing van veldtests als een geschikte test verder uitbreiden naar een bredere omgeving, zoals botanische materiaalmagazijnen en distributiecentra om meer gecompliceerde vragen te beantwoorden. Bovendien, met behulp van meerdere sondes kan de gebruiker ook interne versterking op te nemen in elk reactiesysteem, zodat meer informatie beschikbaar zal zijn wanneer PCR remming wordt vermoed.

Het hier gepresenteerde protocol heeft de volgende voordelen ten opzichte van bestaande technologieën die voor hetzelfde doel worden gebruikt. Ten eerste moeten voor traditionele morfologische en chemische identificatiemethoden de procedure en de resultaten ervan door deskundigen worden uitgevoerd en geïnterpreteerd. qPCR-gebaseerde identificatietests kunnen worden uitgevoerd door mensen met een basisopleiding moleculaire biologie en op een meer gestandaardiseerde manier worden geïnterpreteerd. Ten tweede, in vergelijking met qPCR-gebaseerde soorten identificatie en differentiatie normaal uitgevoerd in het laboratorium, het veld identificatie protocol met behulp van een draagbaar instrument vereist geen instrumenten met een grote voetafdruk, zoals een high-speed centrifuge, DNA-kwaliteit evaluatie-apparatuur, thermische cycler met fluorescentie detector, en een computer met een speciale software. Zo kan dna-gebaseerde soorten identificatie worden uitgevoerd in elke omgeving zonder vertraging. Ten derde, zoeken naar botanische materialen is een taak die een wereldwijde operatie vereist. Met de vooruitgang op het gebied van cloudservices en kunstmatige intelligentie kan een draagbaar apparaat mogelijk methoden ontvangen die zijn ontwikkeld en gevalideerd door experts in het laboratorium, worden beheerd door niet-experts in afgelegen gebieden en objectieve certificeringen van derden produceren. Daarom is deze optie dwingender dan ooit met remote work steeds de trend.

Samengevat, het protocol hier aangetoond veld identificatie van M. chamomilla met behulp van een draagbare qPCR-systeem. De succesvolle toepassing van deze techniek zal zeer nauwkeurige resultaten op botanische identificatie produceren en botanische fabrikanten en leveranciers helpen botanische materialen tijdig en kostenefficiënt te kwalificeren.

Materials

Battery	TNE	78000mAh	Provide field power supply
bCUBE	HYRIS	bCUBE 2.0	Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well)	HYRIS	NA	Consumables for bCUBE
Electric pipette	Eppendorf	NA	Handling liquid
Extract-N-AmpTM plant PCR kit	SIGMA	XNAP2-1KT	Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials	AHP	2264	Used as positive control
Mini dry bath	Yooning	MiniH-100L	For DNA extraction
Nuclease-free water	AMBION	AM9937	qPCR reaction
Primer	Thermo Fisher Scientific	NA	qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials	ChromaDex	ASB-00030806-005	Used as positive control
Luna universal qPCR master mix	NEB	M3003L	qPCR reaction