A مجموعة القطيفة Femtoliter تخليق البروتين موازية على نطاق واسع من جزيئات الحمض النووي واحد
Summary
الهدف العام للبروتوكول هو إعداد أكثر من مليون من قطرات femtoliter أمر، موحدة ومستقرة ومتناسقة بيولوجيا على الركيزة 1 سم2 2 من الألواح التي يمكن استخدامها تخليق البروتين خالية من الخلايا.
Abstract
إن التقدم في التحليل المكاني وحساسية الكشف عن الأجهزة العلمية يجعل من الممكن تطبيق مفاعلات صغيرة في البحوث البيولوجية والكيميائية. لتلبية الطلب على ردود الفعل الدقيقة عالية الأداء، قمنا بتطوير مجموعة قطرات femtoliter (FemDA) الجهاز وتجسد تطبيقه في توليف البروتين خالية من الخلايا موازية على نطاق واسع (CFPS) التفاعلات. تم توليد أكثر من مليون قطرة موحدة بسهولة داخل منطقة بحجم الإصبع باستخدام بروتوكول ختم النفط من خطوتين. كانت كل قطرة راسية في غرفة صغيرة femtoliter تتألف من قاع هيدروفيلي وجانبية مبيدة للماء. الهيكل الهجين الهيدروفيلي في الرهاب المائي وزيوت الختم المخصصة والمواد الراكعة على السطح أمر حاسم للإبقاء بشكل ثابت على محلول الفاتوليتر المائي في الفضاء الفاتوليتر دون فقدان التبخر. تكوين femtoliter وهيكل بسيط من الجهاز FemDA سمح الحد الأدنى من استهلاك الكاشف. وقد جعل البعد الموحد للمفاعلات القطيرة قياسات كمية ومدى زمني واسع النطاق مقنعة وموثوقة. تكنولوجيا FemDA ربطت العائد البروتيني لرد فعل CFPS مع عدد جزيئات الحمض النووي في كل قطرة. قمنا بتبسيط الإجراءات المتعلقة بالتكبير الدقيق للجهاز ، وتشكيل قطرات femtoliter ، واكتساب وتحليل بيانات الصورة المجهرية. البروتوكول التفصيلي مع التكلفة المنخفضة الأمثل التشغيل يجعل التكنولوجيا FemDA في متناول الجميع الذين لديها مرافق غرف نظيفة القياسية والمجهر الفلورانس التقليدية في مكانها الخاص.
Introduction
يستخدم الباحثون مفاعلات لتنفيذ التفاعلات البيولوجية/الكيميائية. وهناك جهود كبيرة بذلت لتخفيض حجم المفاعل وزيادة الإنتاجية التجريبية من أجل خفض استهلاك الكاشف مع تحسين كفاءة العمل. ويهدف كلا الجانبين إلى تحرير الباحثين من عبء العمل الثقيل، وخفض التكلفة وتسريع البحث والتطوير. لدينا خارطة طريق تاريخية واضحة حول تطوير تكنولوجيات المفاعل من وجهة نظر حجم رد الفعل والإنتاجية: قارور واحدة / قارورة / أنابيب الاختبار ، أنابيب المليلتر، أنابيب ميكروليتر، شرائط ميكروليتر 8 أنبوب، ميكرولتر 96/384/1536-well لوحة، وmicrofluidic nanoliter/picoliter/femtoliter مفاعلات1،,2،,3،,4،,5،,6،,7. مماثلة لتقليص حجم السمة من الترانزستورات على رقائق الدوائر المتكاملة في صناعة أشباه الموصلات في العقود الماضية، والمفاعلات الدقيقة الحيوية/الكيميائية تمر من خلال خفض حجم وتكامل النظام. وكان لهذه الأدوات الصغيرة تأثير عميق على الخلايا القائمة على أو الخلايا خالية من البيولوجيا التركيبية، biomanmancturinging، وارتفاع الإنتاجية تقادم وفحص8،9،10،11،12. هذه الورقة تصف جهودنا الأخيرة على تطوير تكنولوجيا مجموعة قطرات فريدة من نوعها ويوضح تطبيقه في CFPS13، وهي تقنية أساسية للبيولوجيا الاصطناعية والمسح الجزيئي المجتمعات14. على وجه الخصوص، نحن نقدم عمدا بروتوكول الأمثل ومنخفضة التكلفة لجعل الجهاز FemDA الوصول إلى الجميع. ومن شأن البروتوكول المنخفض التكلفة والسهل التعامل مع الجهاز المصغر أن يسهم في الأغراض التعليمية للجامعات ويساعد على نشر التكنولوجيا.
FemDA يعد قطرات femtoliter في كثافة عالية جدا من 106 لكل 1 سم2 على الركيزة الزجاجية المفلة. نحن المغلفة البوليمر ماء، CYTOP15، على الركيزة الزجاجية وحفرت بشكل انتقائي (إزالة) CYTOP في مواقف محددة مسبقا لتوليد مجموعة microchamber على الركيزة. وهكذا، وتتألف من microchamber الناتجة عن جدار سفلي (CYTOP) وأسفل هيدروفيلي (الزجاج). عندما يتدفق الماء والزيت على التوالي على السطح المنقوش، يمكن أن يكون محاصرا ومغلقة في microchambers. الهيكل المائي في الرهاب من الماء أمر حيوي لصد المياه خارج الزُنَق الصغيرة، وعزل المفاعلات الدقيقة الفردية، والاحتفاظ بمحلول مائي صغير داخل الفضاء الفاتوليت. تم تطبيق الخاصية الفريدة بنجاح لإعداد قطرات الماء في الزيت والدهون ثنائي الطبقات microcompartments16,17. بالمقارنة مع الجهاز النموذج16، ونحن أول الأمثل عملية microfabrication لتحقيق إزالة كاملة من البوليمر CYTOP وكذلك التعرض الكامل للقاع الزجاجي. CYTOP هو الفلوروبوليمر خاص يتميز التوتر السطحي المنخفض للغاية (19 م إن/ م) أقل من المواد التقليدية متناهية الصغر مثل الزجاج والبلاستيك والسيليكون. وقد تم بالفعل استخدام أدائها البصرية والكهرباء والكيميائية الجيدة في المعالجة السطحية للأجهزة microfluidic18،19،20،21،22،23،24. في نظام FemDA ، لتحقيق التبول الجيد للنفط على سطح CYTOP ، يجب أن يكون التوتر السطحي للنفط أقل من السطح الصلب25. خلاف ذلك، فإن الزيت السائل في اتصال مع سطح صلب يميل إلى أن تصبح كروية بدلا من الانتشار على السطح. إلى جانب ذلك، وجدنا أن بعض الزيوت البيرفلوروكربون شعبية (على سبيل المثال، 3M FC-40)16 والزيوت الهيدروفلورية (على سبيل المثال، سلسلة 3M Novec) يمكن أن تذوب CYTOP نتيجة لmorphology غير متبلور من CYTOP، والتي هي قاتلة للقياس الكمي وسيكون موضع شك من حيث التلوث المتبادل بين قطرات. لحسن الحظ، حددنا النفط صديقة للبيئة وصديقة للبيئة و معارض أقل (< 19 mN/m) التوترالسطحي 13. كما وجدنا السطحي الجديد التي يمكن أن تذوب في النفط المحدد وظيفة في تركيز منخفض (0.1٪، على الأقل 10-fold أقل من تلك التي ذكرت سابقا الشعبية26،27)13. يمكن تثبيت واجهة الماء/الزيت الناتجة عن ذلك بواسطة السطحي. بسبب ارتفاع معدل التبخر من النفط، وبعد تدفق مع النفط، ونحن تطبيق آخر النفط بيوكومباتيبل وصديقة للبيئة لتحل محل أول واحد لختم microchambers. ونحن ندعو النفط الأول (ASAHIKLIN AE-3000 مع 0.1 wt ٪ SURFLON S-386) “تدفق النفط” والنفط الثاني (Fomblin Y25) “النفط الختم” على التوالي.
استراتيجية ختم النفط على خطوتين يمكن تحقيق تشكيل قوي من مجموعة قطرات femtoliter في غضون دقائق ودون أجهزة متطورة. بسبب مشكلة التبخر، فقد اعتبر تحديا لتوليد المفاعلات الدقيقة أصغر من وحدات التخزين picoliter28. وقد عالجت المنظمة هذه المسألة عن طريق تحسين المواد والعمليات المستخدمة لإعداد المفاعلات الدقيقة/القطرات بشكل منهجي. وتشمل العديد من السمات الجديرة بالملاحظة من قطرات الناتجة عن ذلك التوحيد عالية (أو أحادية العرض)، والاستقرار، والمرونة البيولوجية في مقياس femtoliter. معامل الاختلاف (CV) من حجم قطرات هو فقط 3٪ (دون تصحيح التظليل للصور المجهرية)، والسيرة الذاتية أصغر بين منصات قطرات في العالم، والذي يضمن قياس موازي للغاية والكمية. قطرات femtoliter مستقرة لمدة 24 ساعة على الأقل دون تلوث بين قطرات في درجة حرارة الغرفة، وهو أمر قيم لقياس مسار زمني موثوق بها. فيما يتعلق بالتكواؤم الحيوي، نجحنا في تجميع البروتينات المختلفة من الحمض النووي قالب نسخة واحدة في القطيرة femtoliter، والتي كانت تعتبر في السابق صعبة أو غير فعالة29،30. سيكون من الجدير توضيح لماذا بعض البروتينات القادرة على توليفها في FemDA لا يمكن توليفها في أنظمة قطرات أخرى. لم يكن FemDA مجرد تقدم تقني ، ولكنه أدرك أيضًا قياسًا كميًا غير مسبوق يمكن أن يرتبط بين غلة البروتين (كما تعكسه كثافة الفلورانس في القطرة) بعدد جزيئات الحمض النووي في كل قطرة. ونتيجة لذلك، أظهر الرسم البياني لكثافة الفلوريسنس من قطرات من CFPS التي تعتمد على FemDA توزيعًا منفصلًا يمكن تركيبه بشكل جيد من خلال مجموعة من التوزيعات الغاوسية لفواصل زمنية متساوية من الذروة إلى الذروة. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال حدوث قطرات تحتوي على أعداد مختلفة من جزيئات الحمض النووي كان مناسبا تماما لتوزيع بواسون31. وبالتالي، يمكن تطبيع الغلة البروتين مختلفة في كل قطرة على أساس توزيع منفصلة. هذه الميزة الهامة تسمح لنا بفصل معلومات النشاط الأنزيمي عن الكثافة الظاهرة ، التي لم تكن متاحة مع منصات أخرى صغيرة حتى الآن. القائمة microfluidic الخلية / نظم الفرز قطرات المهرة في الفرز التلقائي بالكامل وجيدة في تركيز العينات ولكن في بعض الأحيان يمكن إخراج الرسم البياني واسع نسبيا أو طويل الذيل في الجانب التحليلي32،33. لدينا نظام FemDA الكمية للغاية وبيوتيبلية يضع معيارا جديدا ومقياسا تحليليا عاليا في مجال تطوير microreactor.
الزيوت والمواد الراكعة التي يمكن استخدامها لإعداد قطرات لا تزال محدودة جدا34. مزيج من ASAHIKLIN AE-3000 و SURFLON S-386 أنشئت في FemDA هو عضو جديد في ترسانة المتنامية للواجهة الفيزيائية بين المرحلة مائي ومرحلة النفط13. واجهة جديدة في FemDA هو مستقر ماديا، خاملة كيميائيا، ومتوافقة بيولوجيا مع النسخ المعقدة، والترجمة، وآلات التعديل بعد الترجمة للعديد من أنواع البروتينات13. سيكون من الجذاب العثور على بروتين لا يمكن توليفه في إعدادات القطرات بدلاً من ذلك. الى جانب ذلك ، وتوفير التكاليف من الكواشف هو أكثر وضوحا في نظام القطيرات femtoliter من ذلك في نظم مفاعل نانولتر وpicoliter35،36. على وجه الخصوص، سيكون هناك في كثير من الأحيان حجم ميت كبير، والذي يحدث أساسا عن طريق الأنابيب أو الإمدادات الخارجية، في أنظمة توليد قطرات microfluidic ولكن ليس في FemDA لدينا. كما يفضل تنسيق الصفيف من خلال التوصيف المجهري المتكرر والمفصل (على غرار ما يسمى بتحليل المحتوى العالي) لكل مفاعلواحد 37، بدلاً من لقطة واحدة فقط لجسم سريع الحركة. وقد مكّن مقياس femtoliter من دمج أكثر من مليون مفاعل على مساحة بحجم الإصبع، في حين أن نفس العدد من مفاعلات النانولتر (إذا كان موجوداً) يتطلب أكثر من مساحة متر مربع، وهو ما سيكون بلا شك غير عملي لتصنيع أو استخدام مثل هذا النظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن القياس الكمي للغاية القائم على قطرات موحدة ومستقرة وعالية الاتساق في FemDA، مكّن التوزيع المنفصل، وهي السمة الفريدة لدراستنا التي تختلف عن غيرها. نحن بشكل منهجي الأمثل ومفصلة microfabrication و عمليات تكوين قطرات في هذه الورقة. 10- هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول القائم.
أولا ، ط…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل رقم منحة JSPS KAKENHI JP18K14260 وميزانية الوكالة اليابانية لعلوم وتكنولوجيا البحار والأرض. نشكر شيجيرو ديغوتشي (JAMSTEC) وتيتسورو إيكوتا (JAMSTEC) على توفير مرافق التوصيف. نشكر كين تاكاي (JAMSTEC) على دعم البرمجيات التجارية. أجريت عملية القياس الدقيقة في Takeda Sentanchi Supercleanroom، جامعة طوكيو، بدعم من “برنامج منصة تكنولوجيا النانو” التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT)، اليابان، رقم المنحة JPMXP09F19UT087.
Materials
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
Riferimenti
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
