Her gir vi en detaljert beskrivelse av prosedyren for å indusere kolonoskopisk-guidede klypebiopsier hos mus og spore sårlukking i sanntid. I tillegg er metoder for fremstilling av vev for histologiske, immunohistokjemiske og molekylære analyser av sårsengen gitt.
Forstå vev og cellulære endringer som oppstår i akutt skaderespons så vel som under sårhelingsprosessen er av avgjørende betydning når du studerer sykdommer i mage-tarmkanalen (GI). Den murine kolonklep biopsimodellen er et nyttig verktøy for å definere disse prosessene. I tillegg kan samspillet mellom tarmarminnhold (f.eks. mikrober) og tykktarmen studeres. Imidlertid kan sårinduksjon og evnen til å spore sårlukking over tid på en pålitelig måte være utfordrende. Videre må vevsforberedelse og orientering utføres på en standardisert måte for å optimalt avhøre histologiske og molekylære endringer. Her presenterer vi en detaljert metode som beskriver biopsiindusert skade og overvåking av sårlukking gjennom gjentatte kolonoskopier. En tilnærming er beskrevet som sikrer konsistente og reproduserbare målinger av sårstørrelse, evnen til å samle sårsengen for molekylære analyser, samt visualisere sårsengen ved snitting av vev. Evnen til å utføre disse teknikkene gjør det mulig å studere akutt skaderespons, sårheling og luminalvertinteraksjoner i tykktarmen.
Mage-tarmkanalen (GI) er et komplekst organsystem gitt flere funksjoner, vertscelletyper (f.eks. epitel, immun, stromal, etc.) samt billioner av mikrober. I lys av denne kompleksiteten involverer sykdommer i GI-kanalen ofte samspillet mellom alle disse faktorene. For eksempel er inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) forbundet med sykluser av betennelse og remisjon i GI-kanalen, som involverer aktivering av inflammatoriske celler, dysbiose og epitelreparasjon1,2,3,4,5,6,7. Å ha passende modellsystemer for å studere IBD og andre inflammatoriske tilstander i GI-kanalen er avgjørende for å belyse patogenesen av sykdommen. Flere modeller finnes for å studere IBD patogenese inkludert genmodifiserte mus og bruk av kjemikalier som dextran natriumsulfat (DSS) hos gnagere8,9,10. Begrensninger av disse modellene inkluderer en manglende evne til å nøyaktig kontrollere induksjon av betennelse samt vanskeligheter med å evaluere sårheling. Alternative metoder for å etterligne aspekter av IBD patogenese kan være nyttige for å utvikle terapier.
Colonoskopisk-guidet klype biopsier hos mus tilbyr et nyttig modellsystem for å studere patogenesen av inflammatorisk respons, sårheling, samt vert-mikrobe interaksjoner i tykktarmen. Denne tilnærmingen ble først brukt som et eksperimentelt verktøy i 2009, som viste sitt verktøy for å studere akutt inflammatorisk respons og sårheling i tarmen11. Etterfølgende studier benyttet denne teknikken for å evaluere rollene til forskjellige signalveier samt tarmenmikrobiota, i kolonsårheling11,12,13,14,15,16,17,18. Mer nylig brukte vår gruppe denne modellen til å undersøke viktigheten av sphingosine-1-fosfat signalering og bakterier i akutt respons på colonic skade19. Selv om det er nyttig, kan det være teknisk utfordrende å utføre koloskopiskstyrte klypebiopsier hos mus og evaluere påfølgende vevsendringer. For eksempel kan perforering av tarmen oppstå ved induksjon av skade og sikre konsekvente målinger av sårsengen gjennom serielle kolonoskopier kan være vanskelig. I tillegg kan det være utfordrende å orientere det kolonvevet riktig for å visualisere sårsengen for histologiske eller immunohistokjemiske analyser. Selv om noe informasjon finnes om disse metodene18,20, en presis trinnvis beskrivelse av disse teknikkene sammen vil visuelle hjelpemidler lover å forbedre påliteligheten og bredere nytten av denne modellen. Her presenterer vi en detaljert metode for å utføre kolonoskopisk-guidede klypebiopsier hos mus, spore sårlukking over tid og forberede vevet for å muliggjøre histologiske og molekylære analyser av sårsengen. Opprette en standard metode for å utføre disse teknikkene kan utvide bruken av denne modellen for å studere tidligere uutførte meklere som er potensielt viktig for GI betennelse og sår reparasjon.
Å sikre konsekvente og nøyaktige biopsier samt målinger av sårstørrelse er av avgjørende betydning når man forsøker å effektivt evaluere frekvensen av sårlukking i denne modellen. Derfor bør det tas flere tiltak for å være sikre på at prosedyrene utføres riktig. For det første må dybden av biopsien ikke være for grunn eller dyp. Hvis det er for grunt, vil det ikke være et tilstrekkelig vindu for å evaluere sårlukking. Figur 2 viser en optimal biopsidybde og -størrelse p…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Crohns og Kolitt Foundation (D.C.M) og New York Crohn’s Foundation (D.C.M. og A.J.D.). Forfatterne takker Ms. Carmen Ferrara for hjelp til å lage videoakkompagnementet til denne artikkelen.
Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
isofluorane | Covetrus | 2905 | |
methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |