Questo protocollo dimostra l’uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.
Comprendere quando e dove si verificano interazioni proteina-proteina (IPP) è fondamentale per comprendere la funzione delle proteine nella cellula e in che modo processi più ampi come lo sviluppo sono influenzati. La germina Caenorhabditis elegans è un ottimo sistema modello per studiare gli IPP che sono legati alla regolazione delle cellule staminali, della meiosi e dello sviluppo. Ci sono una varietà di tecniche ben sviluppate che consentono alle proteine di interesse di essere etichettate per il riconoscimento da parte di anticorpi standard, rendendo questo sistema vantaggioso per le reazioni di analisi di legatura di prossimità (PLA). Di conseguenza, il PLA è in grado di mostrare dove gli IPP si verificano in modo spaziale e temporale nelle linee germinali in modo più efficace rispetto agli approcci alternativi. Descritto qui è un protocollo per l’applicazione e la quantificazione di questa tecnologia per sondare gli IPP nella linea germinale di C. elegans.
Si stima che oltre l’80% delle proteine abbia interazioni con altre molecole1, il che sottolinea quanto siano importanti gli IPP per l’esecuzione di specifiche funzioni biologiche nella cellula2. Alcune proteine funzionano come hub che facilitano l’assemblaggio di complessi più grandi che sono necessari per la sopravvivenza delle cellule1. Questi hub mediano più IPP e aiutano a organizzare le proteine in una rete che facilita funzioni specifiche in una cella3 . La formazione di complessi proteici è influenzata anche dal contesto biologico, come la presenza o l’assenza di specifici partner interagenti4, eventi di segnalazione cellulare e fase di sviluppo di una cellula.
C. elegans è comunemente usato come organismo modello per una varietà di studi, compreso lo sviluppo. La semplice anatomia di questo animale è composta da diversi organi, tra cui la gonad, l’intestino e la cuticola trasparente, che facilita l’analisi dello sviluppo del verme. La germinale che si trova nella gonade è un ottimo strumento per studiare come le cellule staminali germinali maturano in gameti5 che si sviluppano in embrioni e, infine, la prossima generazione di progenie. La regione di punta distale della linea germinale contiene un pool di cellule staminali auto-rinnovanti (Figura 1). Quando le cellule staminali lasciano la nicchia, progrediscono nel pachitene meiotico e alla fine si sviluppano in ovociti nella fase dei giovani adulti(Figura 1). Questo programma di sviluppo nella linea germinale è strettamente regolato attraverso diversi meccanismi, tra cui una rete normativa post-trascrizione facilitata dalle proteine che legano l’RNA (RBP)6. Gli IPP sono importanti per questa attività normativa, in quanto gli RRB si associano ad altri cofattori per esercitare le loro funzioni.
Esistono diversi approcci che possono essere utilizzati per eseguire la ricerca di IPP nel worm, ma ognuno ha limitazioni univoche. L’immunoprecipitazioni in vivo (IP) può essere utilizzata per isolare i complessi proteina-proteina da estratti di vermi interi; tuttavia, questo approccio non indica dove si verifica il PPI nel worm. Inoltre, i complessi proteici che sono transitori e si formano solo durante una fase specifica di sviluppo o in un numero limitato di cellule possono essere difficili da recuperare mediante co-immunoprecipitazioni. Infine, gli esperimenti sulla PI devono affrontare le preoccupazioni del riassortimento complesso proteico dopo la lisi e la ritenzione non specifica delle proteine sulla matrice di affinità.
Gli approcci alternativi per il rilevamento in situ degli IPP sono la co-immunostainizzazione, il trasferimento di energia di risonanza di Fàrster (FRET) e il complemento a fluorescenza bimolecolare (BiFC). La co-immunostaining si basa sul rilevamento simultaneo di due proteine di interesse per il tessuto del verme fisso e sulla misurazione dell’entità della colocalizzazione del segnale. L’uso della microscopia a super-risoluzione, che offre maggiori dettagli rispetto alla microscopia standard7, aiuta a testare più rigorosamente la colocalizzazione delle proteine oltre la barriera limitata alla diffrazione di 200-300 nm8. Tuttavia, la co-immunostaining utilizzando microscopia convenzionale e super-risoluzione funziona meglio per le proteine con modelli di localizzazione ben definiti. Al contrario, diventa molto meno informativo per i partner interagenti diffusamente distribuiti. La misurazione per la co-localizzazione dei segnali basata sulla sovrapposizione non fornisce informazioni accurate sul fatto che le proteine siano in complesso tra loro9,10.
Inoltre, la co-immunoprecipitazioni e la co-immunostaining dei complessi proteina-proteina non sono quantitative, il che rende difficile determinare se tali interazioni sono significative. FRET e BiFC sono entrambe tecniche fluorescenti. FRET si basa sull’etichettatura delle proteine di interesse con proteine fluorescenti (FP) che hanno sovrapposizioni spettrali in cui l’energia di un FP (donatore) viene trasferita a un altro FP (accettatore)11. Questo trasferimento non radiativo di energia provoca fluorescenza dell’arbitro FP che può essere rilevato alla rispettiva lunghezza d’onda dell’emissione. BiFC si basa sulla ricostituzione di una proteina fluorescente in vivo. Si tratta di dividere la GFP in due frammenti complementari, come le eliche 1-10 e l’elica 1112, che vengono poi fuse in due proteine di interesse. Se queste due proteine interagiscono, i frammenti complementari di GFP diventano abbastanza vicini in prossimità di piegare e assemblare, ricostituendo il fluoroforo GFP. La GFP ricostituita viene quindi osservata direttamente come fluorescenza e indica dove si è verificato un PPI.
Come tale, sia FRET che BiFC dipendono da grandi tag fluorescenti che possono interrompere la funzione della proteina marcata. Inoltre, FRET e BiFC richiedono un’espressione abbondante e comparabile delle proteine marcate per ottenere dati accurati. FRET potrebbe non essere adatto per esperimenti in cui un partner è superiore all’altro, il che può portare a un alto background13. Anche la sovraespressione negli esperimenti BiFC dovrebbe essere evitata, in quanto ciò può indurre l’assemblaggio non specifico14 che si traduce in un aumento dello sfondo. Entrambe le tecniche richiedono l’ottimizzazione delle condizioni di espressione e imaging delle proteine marcate, che può prolungare il tempo necessario per completare gli esperimenti.
Il saggio di legatura di prossimità (PLA) è un approccio alternativo che può affrontare i limiti delle tecniche di cui sopra. Il PLA sfrutta gli anticorpi primari che riconoscono le proteine di interesse (o i loro tag). Questi anticorpi primari sono poi legati da anticorpi secondari contenenti sonde oligonucleotidi che possono ibridarsi tra loro quando entro una distanza di 40 nm (o più breve)15. Il DNA ibridato risultante viene amplificato attraverso una reazione PCR, che viene rilevata da sonde che completano il DNA. Questo si traduce in foci che vengono visualizzati da un microscopio. Questa tecnologia è in grado di rilevare i PPI in situ in tessuti complessi (cioè la gonaddel a verme), che è organizzata come una catena di assemblaggio contenente cellule in varie fasi di sviluppo e differenziazione. Con il PLA, gli IPP possono essere visualizzati direttamente in una gonad di verme fissa, che è vantaggiosa per indagare se gli IPP si verificano durante una fase specifica dello sviluppo. PLA offre una maggiore risoluzione degli IPP rispetto ai saggi basati sulla co-localizzazione, ideale per effettuare misurazioni precise. Se utilizzata, la microscopia a super-risoluzione ha il potenziale per fornire dettagli più dettagliati sulla posizione dei focolai PLA all’interno di una cellula. Un altro vantaggio è che i foci derivanti dalle reazioni PLA possono essere conteggiati da un flusso di lavoro di analisi basato su ImageJ, rendendo questa tecnica quantitativa.
La famiglia LC8 di catene di luce dynein è stata descritta per la prima volta come una sottounità del complesso motorio di dineina16 e ipotizzata come un adattatore da carico. Fin dalla sua scoperta iniziale, LC8 è stato trovato in più complessi proteici oltre al complesso motorio della dineina17,18,19,20. La scansione delle sequenze proteiche che contengono il motivo di interazione LC819 suggerisce che LC8 può avere molte interazioni con una vasta gamma di proteine diverse17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le proteine della famiglia LC8 sono ora considerate hub che aiutano a promuovere l’assemblaggio di complessi proteici più grandi19,22, come gli assiemi di proteine intrinsecamente disordinate21.
Una proteina di famiglia C. elegans LC8, dynein light chain-1 (DLC-1), è ampiamente espressa su molti tessuti e non arricchita in specifiche strutture subcellulari23,24. Di conseguenza, l’identificazione dei partner in vivo biologicamente rilevanti del DLC-1 in C. elegans è difficile per una serie di motivi: 1) la co-immunoprecipitazioni non indica la fonte di tessuto in cui si verifica l’interazione; 2) l’espressione limitata di particolari partner o interazioni transitorie può ostacolare la capacità di rilevare un’interazione mediante co-immunoprecipitazioni; e 3) la distribuzione diffusa del DLC-1 porta a sovrapposizioni non specifiche con potenziali proteine partner mediante co-immunostaining. Sulla base di queste sfide, PLA è un approccio ideale per testare le interazioni in vivo con DLC-1.
È stato precedentemente riportato che il DLC-1 interagisce direttamente con e funge da cofattore per le proteine che legano l’RNA (RBP) FBF-222 e GLD-125. Il nostro lavoro supporta il modello di DLC-1 che funge da proteina hub e suggerisce che DLC-1 facilita una rete di interazione che si estende oltre la dineina19,22. Utilizzando un’analizzatore GST, è stato identificato un nuovo RBP interagenti DLC-1 denominato OMA-126. OMA-1 è importante per la crescita degli ovociti e la maturazione meiotica27 e funziona in combinazione con un certo numero di repressori e attivatori traslazionali28. Mentre FBF-2 e GLD-1 sono espressi rispettivamente nelle cellule staminali e nelle regioni di pachitene meiotico, OMA-1 è diffusamente nella germinale del guardatene meiotico attraverso gli ovociti27 (Figura 1). Ciò suggerisce che il DLC-1 forma complessi con RBP in diverse regioni della gonade. È stato anche scoperto che l’interazione diretta tra DLC-1 e OMA-1 osservata in vitro non viene recuperata da un IP in vivo. Il PLA è stato utilizzato con successo come approccio alternativo per studiare ulteriormente questa interazione nella linea germinale di C. elegans, e i risultati suggeriscono che il PLA può essere utilizzato per sondare molti altri IPP nel worm.
Quando si studiano gli IPP nella germinacina C. elegans, la risoluzione più alta offerta dalla PLA rispetto alla co-immunostaining consente la visualizzazione e la quantificazione dei luoghi in cui si verificano interazioni nella linea germinale. È stato precedentemente riportato che DLC-1 interagisce direttamente con OMA-1 utilizzando un asdetto pulldown GST in vitro 26; tuttavia, questa interazione non è stata recuperata da un pulldown in vivo. La co-immunostaining fluoresce…
The authors have nothing to disclose.
Alcuni ceppi di nematodi utilizzati in questo studio sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center finanziato dal NIH (P40OD010440). La microscopia confocale è stata eseguita nel Laboratorio di ricerca del nucleo dell’Università del Montana BioSpectroscopia operato con il supporto di NIH Awards P20GM103546 e S10OD021806. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH GM109053 a E.V., dalla American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., e dal premio Montana Academy of Sciences a X.W. I finanziatori non sono stati coinvolti nella progettazione dello studio o nella redazione della relazione. Ringraziamo M. Ellenbecker per la discussione.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |