Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.
Abstract
Zu verstehen, wann und wo Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) auftreten, ist entscheidend für das Verständnis der Proteinfunktion in der Zelle und wie breitere Prozesse wie die Entwicklung beeinflusst werden. Die Caenorhabditis elegans Keimbahn ist ein großartiges Modellsystem zur Untersuchung von PPI, die mit der Regulierung von Stammzellen, Meiose und Entwicklung zusammenhängen. Es gibt eine Vielzahl von gut entwickelten Techniken, die es ermöglichen, Proteine von Interesse für die Erkennung durch Standardantikörper zu kennzeichnen, was dieses System vorteilhaft für Proximity Ligation Assay (PLA) Reaktionen macht. Dadurch kann die PLA zeigen, wo PPI räumlich und zeitlich in Keimlinien auftreten, effektiver als alternative Ansätze. Hier wird ein Protokoll zur Anwendung und Quantifizierung dieser Technologie zur Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn beschrieben.
Introduction
Über 80% der Proteine haben schätzungsweise Wechselwirkungen mit anderen Molekülen1, was unterstreicht, wie wichtig PPI für die Ausführung spezifischer biologischer Funktionen in der Zelle2sind. Einige Proteine fungieren als Naben, die die Montage größerer Komplexe erleichtern, die für das Zellüberleben notwendig sind1. Diese Hubs vermitteln mehrere PPIs und helfen, Proteine in einem Netzwerk zu organisieren, das bestimmte Funktionen in einer Zelle3erleichtert. Die Bildung von Proteinkomplexen wird auch durch den biologischen Kontext beeinflusst, wie das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer interagierender Partner4, Zellsignalereignisse und Entwicklungsstadium einer Zelle.
C. elegans wird häufig als Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien verwendet, einschließlich der Entwicklung. Die einfache Anatomie dieses Tieres besteht aus mehreren Organen, einschließlich der Gonaden, des Darms und der transparenten Nagelhaut, was die Analyse der Wurmentwicklung erleichtert. Die Keimbahn, die sich in der Gonade befindet, ist ein großartiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Keimbahnstammzellen zu Gameten5 reifen, die sich zu Embryonen und schließlich zur nächsten Generation von Nachkommen entwickeln. Der distale Spitzenbereich der Keimbahn enthält einen Pool von sich selbst erneuernden Stammzellen (Abbildung 1). Wenn Stammzellen die Nische verlassen, gelangen sie in das meiotische Pachyten und entwickeln sich schließlich im jungen Erwachsenenstadium zu Eizellen(Abbildung 1). Dieses Entwicklungsprogramm in der Keimbahn wird durch verschiedene Mechanismen streng reguliert, einschließlich eines post-transkriptionspolitischen regulatorischen Netzwerks, das durch RNA-bindende Proteine (RBPs)6erleichtert wird. PPI sind für diese Regulierungstätigkeit wichtig, da RBPs mit anderen Kofaktoren zusammenarbeiten, um ihre Funktionen auszuüben.
Es gibt mehrere Ansätze, die verwendet werden können, um nach PPIs im Wurm zu suchen, aber jeder hat eindeutige Einschränkungen. In vivo Immunpräzipitation (IP) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Komplexe aus ganzen Wurmextrakten zu isolieren; Dieser Ansatz gibt jedoch nicht an, wo der PPI im Wurm auftritt. Darüber hinaus können Proteinkomplexe, die vorübergehend sind und sich nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums oder in einer begrenzten Anzahl von Zellen bilden, durch Co-Immunpräzipation nur schwer zu erholen sein. Schließlich müssen IP-Experimente die Bedenken der Proteinkomplex-Neusortierung nach Lyse und unspezifische Retention von Proteinen auf der Affinitätsmatrix ansprechen.
Alternative Ansätze zur In-situ-Detektion von PPI sind Co-Immunostaining, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC). Co-Immunostaining beruht auf dem gleichzeitigen Nachweis von zwei Proteinen von Interesse in festem Wurmgewebe und der Messung des Ausmaßes der Signalkolokalisierung. Der Einsatz der hochauflösenden Mikroskopie, die detaillierter als die Standardmikroskopie7bietet, hilft, die Proteinkolokalisierung über die beugungsbegrenzte Barriere von 200-300 nm8hinaus strenger zu testen. Die Ko-Immunostainierung mit konventioneller und superhochauflösender Mikroskopie eignet sich jedoch am besten für Proteine mit genau definierten Lokalisierungsmustern. Im Gegensatz dazu wird es für diffus verteilte interagierende Partner viel weniger informativ. Die Messung der Kolokalisierung von Signalen auf der Grundlage von Überlappungen liefert keine genauen Informationen darüber, ob die Proteine komplex miteinander sind9,10.
Darüber hinaus sind Co-Immunpräzipation und Co-Immunostaining von Protein-Protein-Komplexen nicht quantitativ, was es schwierig macht, festzustellen, ob solche Wechselwirkungen signifikant sind. FRET und BiFC sind beide fluoreszierende Techniken. FRET stützt sich auf die Kennzeichnung von Proteinen von Interesse mit fluoreszierenden Proteinen (FPs), die spektrale Überlappung haben, bei der Energie von einem RP (Spender) an ein anderes RP (Akzeptor) übertragen wird11. Diese nicht-radiotive Energieübertragung führt zu einer Fluoreszenz des Akzeptor-FP, die bei seiner jeweiligen Emissionswellenlänge nachgewiesen werden kann. BiFC basiert auf der Rekonstitution eines fluoreszierenden Proteins in vivo. Es beinhaltet die Aufteilung von GFP in zwei komplementäre Fragmente, wie Helices 1-10 und Helix 1112, die dann zu zwei Proteinen von Interesse verschmolzen werden. Wenn diese beiden Proteine interagieren, werden die komplementären Fragmente von GFP in der Nähe nahe genug, um sich zu falten und zu montieren, wodurch das GFP-Fluorophor wieder vorhanden ist. Rekonstituiertes GFP wird dann direkt als Fluoreszenz beobachtet und gibt an, wo ein PPI aufgetreten ist.
Daher sind sowohl FRET als auch BiFC auf große fluoreszierende Tags angewiesen, die die Funktion des markierten Proteins stören können. Darüber hinaus benötigen FRET und BiFC eine reichliche und vergleichbare Expression der markierten Proteine, um genaue Daten zu erhalten. FRET ist möglicherweise nicht für Experimente geeignet, bei denen ein Partner über dem anderen liegt, was zu einem hohen Hintergrund führen kann13. Auch eine Überexpression in BiFC-Experimenten sollte vermieden werden, da dies zu einer unspezifischen Assembly14 führen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führt. Beide Techniken erfordern eine Optimierung der Expression und der bildgebenden Bedingungen der markierten Proteine, was die Zeit verlängern kann, die für die Abschluss von Experimenten erforderlich ist.
Der Proximity Ligation Assay (PLA) ist ein alternativer Ansatz, der die Grenzen der oben genannten Techniken angehen kann. PLA nutzt primäre Antikörper, die die Proteine von Interesse (oder ihre Tags) erkennen. Diese primären Antikörper werden dann durch sekundäre Antikörper gebunden, die Oligonukleotid-Sonden enthalten, die sich innerhalb eines Abstands von 40 nm (oder kürzer)15miteinander hybridisieren können. Die resultierende hybridisierte DNA wird durch eine PCR-Reaktion verstärkt, die von Sonden nachgewiesen wird, die die DNA ergänzen. Daraus ergeben sich Brennpunkte, die mit einem Mikroskop visualisiert werden. Diese Technologie kann PPI vor Ort in komplexen Geweben (d. h. dem Wurmgonaden) erkennen, der als Fließband organisiert ist, das Zellen in verschiedenen Entwicklungs- und Differenzierungsstadien enthält. Mit PLA können PPIs direkt in einem festen Wurmgonaden visualisiert werden, was vorteilhaft für die Untersuchung ist, ob PPI in einer bestimmten Entwicklungsphase auftreten. PLA bietet eine höhere Auflösung von PPIs im Gegensatz zu co-localization-basierten Assays, die ideal für präzise Messungen sind. Wenn sie verwendet wird, hat die superhochauflösende Mikroskopie das Potenzial, detailliertere Details über die Position von PLA-Brennpunkten innerhalb einer Zelle zu liefern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die brennpunkteherreichen PLA-Reaktionen durch einen ImageJ-basierten Analyse-Workflow gezählt werden können, was diese Technik quantitativ macht.
Die LC8-Familie von Dynein-Lichtketten wurde zuerst als Untereinheit des Dynein-Motorkomplexes16 beschrieben und als Frachtadapter vermutet. Seit seiner ersten Entdeckung wurde LC8 in mehreren Proteinkomplexen neben dem Dynein-Motorkomplex17,,18,,19,20gefunden. Das Scannen nach Proteinsequenzen, die das LC8-Interaktionsmotiv19 enthalten, legt nahe, dass LC8 viele Wechselwirkungen mit einer Vielzahl verschiedener Proteine haben kann17,18,19,20,21,22. Als Ergebnis gelten Proteine der LC8-Familie heute als Naben, die die Montage größerer Proteinkomplexe19,22, wie Assemblys von intrinsisch ungeordneten Proteinen21, fördern.
Ein C. elegans LC8-Familie Protein, Dynein light chain-1 (DLC-1), ist weit verbreitet über viele Gewebe und nicht in spezifischen subzellulären Strukturen angereichert23,24. Folglich ist die Identifizierung biologisch relevanter In-vivo-Partner von DLC-1 in C. elegans aus einer Reihe von Gründen eine Herausforderung: 1) Die Co-Immunpräzipation gibt nicht die Gewebequelle an, in der die Wechselwirkung auftritt; 2) eine begrenzte Expression bestimmter Partner oder vorübergehende Wechselwirkungen kann die Fähigkeit behindern, eine Wechselwirkung durch Ko-Immunpräzipation zu erkennen; und 3) die diffuse Verteilung von DLC-1 führt zu unspezifischen Überschneidungen mit potenziellen Partnerproteinen durch Co-Immunostaining. Basierend auf diesen Herausforderungen ist PLA ein idealer Ansatz, um In-vivo-Interaktionen mit DLC-1 zu testen.
Es wurde bereits berichtet, dass DLC-1 direkt mit den RNA-bindenden Proteinen (RBPs) FBF-223 und GLD-125interagiert und als Cofaktor dient. Unsere Arbeit unterstützt das Modell von DLC-1, das als Nabenprotein dient, und schlägt vor, dass DLC-1 ein Interaktionsnetzwerk ermöglicht, das sich über Dynein19,22hinaus erstreckt. Mit einem GST-Pulldown-Assay wurde ein neuer DLC-1-interagierender RBP namens OMA-1 identifiziert26. OMA-1 ist wichtig für Eizellenwachstum und meiotische Reifung27 und funktioniert in Verbindung mit einer Reihe von translationalen Repressoren und Aktivatoren28. Während FBF-2 und GLD-1 in den Stammzellen bzw. meioten Pachytenregionen exprimiert werden, wird OMA-1 in der Keimbahn aus dem meiotischen Pachyten durch die Eizellen27 diffus exprimiert (Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass DLC-1 komplexe Komplexe mit RBPs in verschiedenen Regionen des Gonaden bildet. Es wurde auch festgestellt, dass die direkte Interaktion zwischen DLC-1 und OMA-1, die in vitro beobachtet wurde, nicht durch ein In-vivo-IP wiederhergestellt wird. Die PLA wurde erfolgreich als alternativer Ansatz verwendet, um diese Wechselwirkung in der C. elegans Keimbahn weiter zu untersuchen, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PLA verwendet werden kann, um viele andere PPI im Wurm zu untersuchen.
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Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet C. elegans-Stämme, bei denen potenzielle interagierende Partner mit Tags versehen sind. Es wird dringend empfohlen, einen Negativkontrollstamm zu verwenden, bei dem nicht erwartet wird, dass ein markiertes Protein mit einem anderen markierten Kandidaten-Interaktionspartner interagiert. Hier wurde GFP allein als Negativkontrolle verwendet, um den Hintergrund zu bewerten, da nicht erwartet wird, dass DLC-1 mit GFP im Wurm interagiert. ALS experimenteller Stamm wurde MIT GFP-tags OMA-1 verwendet, da vorläufige Daten auf eine Wechselwirkung mit DLC-1 hindeuten. Nematode-Stämme, die Kontroll- und Testproteine mit 3xFLAG-getaggtem DLC-1 koexieren, werden in diesem Text als 3xFLAG::DLC-1 bezeichnet; GFP und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Stämme auf Anfrage erhältlich; weitere Informationen in der Tabelle der Materialien), bzw. Hier werden die 3xFLAG- und GFP-Tags verwendet; andere Tags können jedoch ersetzt werden, solange ihre Antikörper mit den PLA-Kit-Reagenzien kompatibel sind.
1. Tierpflege
- Halten Sie Würmer auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit dem OP50-Stamm von E. coli gesät sind, und halten Sie bei 24 °C für eine optimale Expression von GFP.
- Durchreise erwachsene Würmer alle 2-3 Tage, um Würmer zu vermehren und sie gut ernährt zu halten.
2. Vorbereitung der Synchronkultur
- Synchronisieren Sie Würmer, indem Sie eine Platte mit gut gefütterten, gravid Hermaphroditen bleichen. Ein Bleichprotokoll wird in Porta-de-la-Riva et al.29beschrieben. Lassen Sie die Embryonen über Nacht in einem Zentrifugenrohr bei 24 °C schlüpfen, während sie sich in 10 ml M9-Minimalmedia(M9)-Puffer über Ende drehen. Dies wird eine Kultur der verhafteten L1-Larven produzieren.
- Inkubieren Sie die Röhre der verhafteten L1-Bühnenlarven auf Eis für 10 min, dann top off die Röhre mit eiskalten 1x M9.
- Verwenden Sie eine Zentrifuge, um die Larven bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zu pellet. Sorgsam den Überstand ansaugen, so dass nur noch 1-2 ml Überstand übrig bleiben.
- Das Pellet der Larven wieder aufhängen und mit einer Mikropipette 2 l schwebende Larvenkultur auf eine Glasrutsche übertragen. Zählen Sie, wie viele Larven vorhanden sind, um die Dichte der Larvenkultur zu bestimmen, was dazu beitragen wird, die Aussaat der Würmer in Schritt 2.5 zu leiten.
HINWEIS: Eine Dichte von 10-15 L1-Larven/1 L eignet sich gut für die Aussaat. - Verwenden Sie eine Mikropipette, um das Volumen der Larvenkultur zu übertragen, die benötigt wird, um etwa 100-120 L1-Stufenlarven auf einer 60 mm OP50-Platte auszusäen. Zum Beispiel Samen 10 L einer Larvenkultur, die eine Dichte von 10 L1 Larven/1 l Kultur hat.
HINWEIS: Überschreiten Sie nicht ein Volumen von 40 l, um die Larven auszusäen, oder überschüssige Flüssigkeit wird den OP50 Rasen stören. Wenn das Kulturvolumen 40 l überschreitet, wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.4, um das Volumen weiter zu reduzieren und die Larvenkultur zu erhöhen. - Würmer bei 24 °C anbauen. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der L1s auf dem Teller gesät werden, und überprüfen Sie regelmäßig den Entwicklungsstand, um den idealen Zeitpunkt für die Zerlegung zu ermitteln.
HINWEIS: Bei 52 h nach der Aussaat von L1s sind Würmer, die bei 24 °C kultiviert werden, typischerweise im Jungen Erwachsenenstadium, was die ideale Phase für die Zerlegung von Gonaden-gezielten PLA ist. Der tatsächliche Zeitpunkt, zu dem die synchronisierten Würmer das Stadium des jungen Erwachsenen erreichen, kann jedoch je nach Dehnung und Inkubationstemperatur variieren.
3. Dissektion/Gonadenextrusion
HINWEIS: Die Dissektion, um die Gonade zu extrudieren, ist notwendig, damit die auf Gonaden ausgerichtete PLA erfolgreich funktioniert. Dieser Ansatz kann auch Embryonen freisetzen, die auch mit diesem Protokoll für PLA funktionieren (weitere Informationen finden Sie unter Diskussion). Nach der Zerlegung werden sowohl die Negativkontroll- als auch die Versuchsproben fixiert und parallel für PLA behandelt. Es wird auch vorgeschlagen, einen zusätzlichen Satz von Proben für den Zweck der fluoreszierenden Co-Immunostaining23 vorzubereiten, um Expressionsmuster der Proteinpartner von Interesse zu demonstrieren.
- Wählen Sie 30-40 junge erwachsene Würmer in eine Uhrglasschale mit 500 l 1x M9 + Levamisol (2,5 mM Endkonzentration). Nach dem Sammeln der Würmer, entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
- Fügen Sie frische 500 l von 1x M9 + Levamisol hinzu und verwenden Sie die Pipette, um das Medium sanft zu erstellen und auszugeben, um die Würmer zu spülen. Entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu löschen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
- Wiederholen Sie diesen Schritt 2x-3x, bis alle Bakterien entfernt sind. Nachdem die Wäbungen abgeschlossen sind, lassen Sie Würmer in etwa 100 L Medien, um hydratisiert zu halten.
HINWEIS: Lassen Sie die Würmer nicht länger als 7 min in den Medien sitzen, da dies die Extrusion von Gonaden während der Zerlegung beeinträchtigt. Führen Sie Wähungen mit Hilfe eines Sezierensmikroskops durch, um die Entfernung von Medien zu überwachen, damit Würmer nicht verloren gehen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt 2x-3x, bis alle Bakterien entfernt sind. Nachdem die Wäbungen abgeschlossen sind, lassen Sie Würmer in etwa 100 L Medien, um hydratisiert zu halten.
- Übertragen Sie Würmer mit einer Glas- oder Polyethylenpipette auf einen 25 mm x 75 mm Mikroskopschlitten, der mit 0,001 % Poly-L-Lysin beschichtet ist (die bei diesem Verfahren verwendeten Dias haben einen Epoxid-beschichteten Umfang, so dass drei Arbeitsbereiche mit jeweils 14 mm x 14 mm vorhanden sind). Entfernen Sie überschüssige Medien, so dass ca. 10-15 L Medien übrig bleiben.
- Legen Sie mit Hilfe eines Sezierendes Mikroskops und mit zwei 261/2-Messnadeln eine Nadel über die andere, so dass die Enden eine Schere bilden. Schneiden Sie mit Nadeln, die auf diese Weise ausgerichtet sind, Würmer hinter dem Rachen, um die Keimbahnen freizusetzen. Sezieren Sie alle Würmer innerhalb von 5 Minuten.
HINWEIS: Weitere Einzelheiten zur Durchführung von Sezierungen finden Sie in einer früheren Publikation von Gervaise und Arur30. - Nachdem alle Würmer seziert sind, legen Sie vorsichtig einen 22 mm x 40 mm Deckel über den Schlitten, so dass er senkrecht zum Schlitten ist. Die Enden des Coverslips sollten an der Rutsche hängen.
- Einfrieren Sie die Rutschen auf einem vorgekühlten Aluminiumblock, der mindestens 20 min auf Trockeneis gehalten wird. Legen Sie vorsichtig einen gekühlten Bleistift auf den Deckel, um zu verhindern, dass sich der Deckelrutsch durch Eisausdehnung löst.
4. Fixierung/Blockierung
- Wenn Sie zur Fixierung bereit sind, die Abdeckungen mit einem Bleistift oder einem anderen stumpfkantigen Werkzeug abstreifen und das Dia sofort 1 min in ein Glas mit frischem, eiskaltem Methanol (gekühlt auf -20 °C) tauchen.
- Wischen Sie die Ränder des Dias, die die Probe umgeben, vorsichtig ab, sodass das nächste Reagenz durch Oberflächenspannung um die Probe gehalten wird. 150 l fixativ (2% Formaldehyd in 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) für 5 min bei RT auftragen.
HINWEIS: Wir haben auch ein Methanol/Aceton-Fixierungsverfahren31,32 getestet und festgestellt, dass es mit der PLA-Reaktion kompatibel ist. - Berühren Sie den Schlitten in einem senkrechten 90°-Winkel auf ein Papiertuch, um das Fixiergerät vom Schlitten laufen zu lassen und in das Papiertuch zu absorbieren. Block-Dias 2x für 15 min bei RT in einem Coplin-Glas mit 50 ml 1x PBS/1% Triton X-100/1% Rinderserumalbumin (PBT/BSA).
HINWEIS: Coplin-Gläser oder andere Arten von Färbegläsern werden für diesen Sperrschritt und die Waschschritte unten in den Abschnitten 6-9 empfohlen. Diese bieten ausreichende Volumina für einen effizienten Austausch von Blockierungs- oder Waschpuffer mit der Probe. - Blockschlitten mit einer PBT/BSA-Lösung, die 10% normales Ziegenserum enthält. Wischen Sie die Kanten, die den Schlitten umgeben, vorsichtig ab und tragen Sie 100 l der Lösung auf die Folie auf. 1 h bei RT in einer feuchten Kammer inkubieren.
ANMERKUNG: Dieser Schritt wird dringend empfohlen, um mit dem primärantikörper "FLAG" zu färben. Die feuchte Kammer wird durch Diesicherung von Glaspipetten mit Klebeband in der Schale für die Rutschen auf zu legen, wie sie inkubieren. Gedämpfte Aufgabentücher (Materialtabelle) werden in das Fach gelegt, um die innere Feuchtigkeit des Fachs zu erhöhen, um Verdunstung zu verhindern. Der Deckel und die Schale sind mit Folie abgedeckt, um die Proben während der lichtempfindlichen Schritte vor Licht zu schützen. - Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, damit die PBT/BSA/10%NGS-Lösung vom Schlitten abläuft und die Ränder des Schlittens sanft abwischen. Verwenden Sie das blockierende Reagenz (Materialtabelle), um Folien zu blockieren. Tragen Sie einen Tropfen auf den Raum von 14 mm x 14 mm auf. Inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C in einer feuchten Kammer.
5. Primäre Antikörperinkubation
HINWEIS: Um die besten PLA-Ergebnisse und minimalen Hintergrund zu erhalten, kann der Verdünnungsfaktor der primären Antikörper optimiert werden müssen (weitere Details finden Sie unter Diskussion). Darüber hinaus sollten die primären Antikörper in verschiedenen Hosts ausgelöst werden, die der Spezifität der sekundären Antikörper entsprechen, die für PLA verwendet werden.
- Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, damit das blockierende Reagenz von der Folie abläuft und die Ränder sanft abwischen. Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle), um die primären Antikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 l Primärantikörperlösung pro 14 mm x 14 mm Raum auf.
- Inkubieren gleitet in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C.
6. PLA-Sonde (sekundärer Antikörper) Inkubation
HINWEIS: Verwenden Sie für die Schritte 6-9 die Waschpuffer A und B bei RT. Wenn die Puffer bei 4 °C gelagert werden, lassen Sie sie vor der Verwendung auf RT erwärmen.
- Waschen Sie Dias 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A (Materialtabelle) bei RT in einem Coplin Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
- Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, um den Waschpuffer von der Folie laufen zu lassen und die Kanten vorsichtig abzuwischen. Bereiten Sie eine 40-L-Lösung mit PLUS- und MINUS-Sonden (verdünnt 1:5 mit Antikörperverdünnung) vor. Tragen Sie die Lösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 1 h bei 37 °C.
7. Ligation
- Schlitten 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
- Verdünnen Sie den Ligationspuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase (Tabelle der Materialien) 1:40 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand der Ligationslösung vorzubereiten.
- Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft und die Kanten sanft abwischen. Tragen Sie 40 l der Ligationslösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 30 min bei 37 °C.
8. Verstärkung
HINWEIS: Die Verwendung von Detektionsreagenzien mit roten Fluorophoren (Materialtabelle) führt zu der geringsten Menge an Hintergrund im C. elegans Gewebe.
- Schlitten 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
- Den Amplifikations-Rotpuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser verdünnen. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Polymerase (Materialtabelle) 1:80 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand an Amplifikationslösung vorzubereiten und vor Licht zu schützen.
- Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft und die Kanten sanft abwischen. Tragen Sie 40 l der Amplifikationslösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 1 h und 40 min bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass die feuchte Kammer mit Folie bedeckt ist, um die Proben vor Licht zu schützen.
9. Letzte Wähungen
- Schlitten 2x für 10 min mit 50 ml 1x Waschpuffer B (Materialtabelle) bei RT in einem Coplin Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
- Schlitten 1x für 1 min mit 50 ml 0,01x Waschpuffer B bei RT in einem Coplin Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Dieser Puffer wird durch Verdünnen von Waschpuffer B mit Reinstwasser hergestellt.
10. Coverslip-Montage
- Lassen Sie den überschüssigen Waschpuffer von der Rutsche auf ein Papiertuch laufen und wischen Sie den verbleibenden Restpuffer auf dem epoxybeschichteten Umfang des Dias ab.
- Fügen Sie 10 L Desmontagemedium(Materialtabelle) zur Probe hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf darauf, so dass sich das Montagemedium ausbreiten kann.
- Malen Sie um den Rand des Coverslip mit Nagellack, um den Deckelschlupf zu versiegeln und zu gleiten. Seien Sie sanft mit der Anwendung von Nagellack, um zu vermeiden, dass der Deckelrutsch bewegt wird, was die Keimbahnen beschädigen wird. Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 min bei RT aushärten, während die Dias vor Licht geschützt sind, bevor Sie ihn unter dem Mikroskop betrachten.
- Lagern Sie Dias in einem dunklen Behälter oder Diahalter, da PLA-markierte Proben lichtempfindlich sind. Der Hersteller schlägt vor, dass Dias bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung gelagert werden können. Die mit diesem Protokoll erstellten Folien halten mindestens 2 Monate, wenn sie bei 20 °C gelagert werden.
11. Bildaufnahme
- Verwenden Sie zur Quantifizierung ein konfokales Mikroskop, um Bilder von extrudierten Keimlinien zu erfassen, die sich in freier Sicht, unbeschädigt und ungehindert befinden. Erfassen Sie einen Z-Stack der Keimbahn, der die gesamte Keimbahn in der Z-Ebene überspannt, und erzeugen Sie ein maximales Projektionsbild, das für die Quantifizierung verwendet werden kann.
HINWEIS: Die konfokale Mikroskopie ist ideal für die Gewinnung und Quantifizierung von PLA-Bildern mit weniger Hintergrund im Vergleich zu denen, die mit einem Epifluoreszenzmikroskop erhalten wurden.- Wenn die Keimbahn nicht in ein Sichtfeld passt, erfassen Sie die überlappenden Sichtfelder nach Bedarf, um die gesamte Keimbahn abzubilden. Maximale Projektionen dieser Bilder können in FIJI zusammengenäht werden.
- Achten Sie darauf, die Bildbedingungen zwischen Kontroll- und Versuchsproben gleich zu halten, um einen fairen und angemessenen Schwellenwert für die Identifizierung von Brennpunkten während der Bildanalyse festzulegen.
HINWEIS: Erfassen Sie mindestens 8-10 Keimlinien aus jeder Probe pro Replikation, um die statistische Analyse der PLA-Quantifizierung zu erleichtern. Mindestens drei biologische Repliken werden für PLA empfohlen, um zuverlässige und konsistente quantitative Ergebnisse zu erzielen.
12. Bildanalyse und Quantifizierung mit FIJI/ImageJ
HINWEIS: Der folgende Workflow basiert auf Bildern, die mit dem 40-fachen Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, in dem Bilder im .czi-Format gespeichert werden. Diese .czi-Bilder und die dazugehörigen Metadaten, einschließlich Der Dimensionen, können in FIJI/ImageJ zur weiteren Analyse abgerufen und geöffnet werden. Es sollte geprüft werden, ob FIJI das Format der konfokalen Dateien aus dem konfokalen akzeptiert, das dem jeweiligen Benutzer zur Verfügung steht. Wenn dies nicht der Fall ist, können Bilder im .tiff-Format alternativ für die Analyse verwendet werden, aber der Benutzer muss den Maßstab des Bildes manuell in FIJI/ImageJ (Analyze | Set-Skala). Es wird empfohlen, alle negativen Kontrollbilder zuerst zusammen zu analysieren, um die Hintergrundebene zu ermitteln.
- Starten Sie den Analyseworkflow, indem Sie zuerst alle negativen Kontrollbilder analysieren und dann zu den experimentellen Beispielen übergehen. Öffnen Sie ein maximales Projektionsbild in FIJI/ImageJ, um es zu analysieren (Abbildung 2A). Wenn Sie eine .czi-Datei verwenden, wird ein Feld Bio-Formats Import Options aufgefordert.
- Fügen Sie die folgenden Optionen hinzu, um Ihr Bild zu öffnen: Ansichtsstapel mit Datenbrowser; Farbmodus = Koloriert. Ein Fenster mit dem Bild sollte nun mit einer Schiebeleiste geöffnet werden, um zwischen verschiedenen Kanälen umzuschalten, die von konfokalen Kanälen erfasst werden (z. B. DAPI oder PLA).
- Wenn Bilder genäht werden müssen, erstellen Sie Duplikate jedes Kanals aus jedem Bild, indem Sie das Bild mit der Maus rechts auswählen und Duplizieren auswählen, um das Fenster Duplizieren zu öffnen. Geben Sie nur die Kanalnummer (c) an, die dem PLA- oder DAPI-Kanal entspricht (z. B. 2), und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für Duplicate Hyperstack.
- Wenn beide Bilder geöffnet werden sollen, wählen Sie Plugins | Nähte | Veraltet | 2D-Nähte. Ein Stitching of 2D Images-Fenster wird geöffnet. Wählen Sie aus, welche Bilder zum Heften verwendet werden sollen, und verwenden Sie die Standardparameter, die im Fenster voreingestellt sind, und wählen Sie dann Okaus. Das resultierende Bild ist ein zusammengesetztes Graustufenbild.
HINWEIS: Wenn die Unterbilder nicht perfekt ausgerichtet sind, passen Sie die Parameter an (d. h. die Anzahl der zu überprüfenden Spitzen von 5 auf 500 erhöhen oder die Fusionsmethode von Linear Blending auf Max ändern. Intensität) kann helfen, das gewünschte Bild zu erhalten. Während andere Nähwerkzeuge zur Verfügung stehen, behält dieser Ansatz die Dimensionalität des Bildes bei, was für die Quantifizierung wichtig ist.
- Öffnen Sie den ROI-Manager (Region of Interest), indem Sie T auf der Tastatur drücken. Ein neues Fenster mit dem Namen ROI Manager wird geöffnet.
- Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus dem Feld FIJI-Toolset aus. Drop-Punkte um die Keimbahn, um sie zu skizzieren und einen ROI zu generieren (Abbildung 2B). Verbinden Sie den letzten Punkt mit dem ersten Punkt, um einen vollständigen ROI zu generieren.
HINWEIS: Bei dunkleren Bildern ist es hilfreich, den Kontrast anzupassen, um die Sichtbarkeit der Keimbahn (die reversibel ist) zu verbessern, damit sie genauer umrissen werden kann.- Gehen Sie unmittelbar nach Abschluss des ROI zum ROI-Manager, und wählen Sie Hinzufügen [t] aus, um den ROI zu speichern. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Änderungen am ROI, einschließlich hinzufügen/entfernen von Punkten oder Bewegung des ROI und der Punkte aktualisiert werden (wählen Sie Aktualisieren vom ROI-Manager), bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, oder sie gehen verloren. Weitere Details zur Manipulation von ROIs und deren Punkten finden Sie im FIJI/ImageJ-Benutzerhandbuch.
- Sobald die ROI-Ausrichtung festgelegt ist, kann sie für eine spätere Referenz gespeichert werden, indem Sie den ROI-Namen im ROI-Manager gefolgt von Mehr | Speichern | (Namensdatei und Angabe des Ziels, wo gespeichert werden soll). Gespeicherte ROIs können im ROI-Manager geöffnet werden, indem Sie Mehr | Öffnen | (wählen Sie die Datei aus).
- Messen Sie den Bereich innerhalb des ROI, indem Sie den ROI-Namen aus dem ROI-Manager auswählen und dann die Schaltfläche Messen im ROI-Manager auswählen. Ein Ergebnisfenster wird mit Informationen über den ROI geöffnet, einschließlich des2Bereichs, den er im Bild abdeckt (Einset von Abbildung 2B). Zeichnen Sie diese Informationen in einer Kalkulationstabelle für nachfolgende Berechnungen auf.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Maßstab des Bildes richtig eingestellt wurde, damit die richtigen Abmessungen des ROI erfasst werden. Die im Feld Ergebnisse gemeldeten Messtypen können geändert werden, indem Sie zu Analysieren | Messen festlegen.... - Öffnen Sie ein doppeltes Bild nur des PLA-Kanals, indem Sie das PLA-Bild rechts auswählen und Duplizieren auswählen (Abbildung 2C). Ein Duplikatfenster wird geöffnet. Geben Sie nur die Kanalnummer (c) an, die dem PLA-Kanal entspricht (z. B. 2), und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für Duplicate Hyperstack. Es wird empfohlen, dieses Bild zu duplizieren, damit das Originalbild nicht geändert wird.
HINWEIS: Diese Optionen werden nur angezeigt, wenn die Bilder angezeigt werden, die mehrere Kanäle auf FIJI/ImageJ enthalten. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Kanäle zu teilen Image | Farbe | Split Channels, aber dies ändert Ihre ursprüngliche Bilddatei. - Wenn nur das Bild des PLA-Kanals ausgewählt ist, gehen Sie zu Bild | Anpassen | Schwellenwert. Ein Schwellenwertfenster für das Bild wird geöffnet. Wählen Sie Standard als Schwellenwertmethode, Rot als Farbe und das Kontrollkästchen Dunkles Hintergrundaktivieren aus. Schieben Sie die Leiste mit der oberen Spur im Fenster nach rechts, bis alle PLA-Brennpunkte im Bild deutlich hervorgehoben sind.
- Zeichnen Sie den Wert im Feld rechts von der oberen Spur auf, und notieren Sie, welcher Wert zum Festlegen des Schwellenwerts verwendet wurde. Wählen Apply Sie Im Fenster Schwellenwert anwenden aus, um den Schwellenwert zu finalisieren, und das Bild wird in einen weißen Hintergrund konvertiert, wobei nur die Schwellenwerte als schwarze Punkte sichtbar sind (Abbildung 2D). Testen Sie den Schwellenwert für mehrere Negative-Kontrollbilder, um sicherzustellen, dass er für die Erfassung aller PLA-Brennpunkte von Bild zu Bild vor der Quantifizierung geeignet ist.
ANMERKUNG: Um Schwellenwert-Brennpunkte als schwarze Punkte auf weißem Hintergrund anzuzeigen, gehen Sie zu Prozess | Binär | Optionen... und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Schwarzer Hintergrund". Ein Schwellenwert zwischen 30-40 ist ein guter Ausgangspunkt für die Identifizierung von PLA in der Keimbahn; Der ideale Wert kann jedoch je nach Hintergrund variieren.
- Zeichnen Sie den Wert im Feld rechts von der oberen Spur auf, und notieren Sie, welcher Wert zum Festlegen des Schwellenwerts verwendet wurde. Wählen Apply Sie Im Fenster Schwellenwert anwenden aus, um den Schwellenwert zu finalisieren, und das Bild wird in einen weißen Hintergrund konvertiert, wobei nur die Schwellenwerte als schwarze Punkte sichtbar sind (Abbildung 2D). Testen Sie den Schwellenwert für mehrere Negative-Kontrollbilder, um sicherzustellen, dass er für die Erfassung aller PLA-Brennpunkte von Bild zu Bild vor der Quantifizierung geeignet ist.
- Um die PLA-Schwerpunkte zu quantifizieren, wenden Sie den roi aus den Schritten 12.3-12.3.1 auf das Schwellenwertbild an, indem Sie den ROI-Namen aus dem ROI-Manager-Fenster auswählen. Die Umrisslinie des ROI sollte auf dem Bild an der gleichen Stelle wie aus dem Quellbild angezeigt werden (Abbildung 2E).
- Gehen Sie zu Analysieren | Analysieren von Partikeln. Das Fenster Partikel analysieren öffnet sich und wählt die folgenden Parameter aus: Größe (Mikron 2) = 0-Unendlichkeit, Zirkularität = 0,00-1,00, anzeigen = Nichts. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen.
- Wählen Sie Okaus, und eine Zusammenfassungstabelle wird mit Informationen über den ROI (d. h. die Gesamtzahl der PLA-Brennpunkte, die Gesamtfläche, die von den PLA-Brennpunkten im ROI belegt wird, die durchschnittliche Größe der PLA-Brennpunkte und den Prozentsatz der fläche, die von PLA-Brennpunkten im Verhältnis zur Größe des ROI belegt wird) angezeigt (Einset von Abbildung 2E). Zeichnen Sie diese Messungen in einer Kalkulationstabelle auf.
- Wiederholen Sie die Schritte 12.1-12.8 für mehrere Negative-Kontrollbilder mit demselben Schwellenwert.
- Nachdem alle negativen Kontrollbilder analysiert wurden, wiederholen Sie die Schritte 12.1-12.8 für alle experimentellen Proben mit demselben Schwellenwert, der durch die negative Kontrolle bestimmt wurde, um PLA-Brennpunkte zu identifizieren und zu quantifizieren.
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Representative Results
Co-Immunostaining beider 3xFLAG::DLC-1; GFP und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-Keimbahnen mit FLAG- und GFP-Antikörpern zeigten ihre Expressionsmuster in der Keimbahn (Abbildung 3Aii-iii,3Bii-iii). Während GFP in der gesamten Keimbahn exprimiert wurde (Abbildung 3Aiii), war die OMA-1::GFP-Expression auf die späten Pachyten und Eizellen beschränkt (Abbildung 3Biii)27. DIE FLAG-Immunostainierung zeigt, dass 3xFLAG::DLC-1 in beiden Stämmen in der Keimbahn exprimiert wurde (Abbildung 3Aii,3Bii). Durch Co-Immunostaining ist die Überlappung zwischen 3xFLAG::DLC-1 und OMA-1::GFP nicht von der zwischen 3xFLAG::DLC-1 und GFP (Negativkontrolle) zu unterscheiden.
Da diese Experimente auf Wechselwirkungen zwischen DLC-1 und OMA-1 getestet wurden, umfasste der Bereich von Interesse für die PLA-Quantifizierung in der Keimbahn das späte Pachyten durch die Eizellen in allen untersuchten Keimlinien (Abbildung 2B), da dies der Bereich der OMA-1-Expression ist (Abbildung 1, Abbildung 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-Keimbahnen schienen in dieser Region eine größere Menge an PLA-Brennpunkten zu haben als die 3xFLAG::DLC-1; GFP-Keimbahnen (Abbildung 3Ciii-iv,3Diii-iv). Die Quantifizierung von PLA ergab, dass die Anzahl der PLA-Brennpunkte in 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP Keimbahnen war deutlich größer als 3xFLAG::DLC-1; GFP (Abbildung 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tabelle 1). Darüber hinaus war der Unterschied zwischen der Kontrolle und dem experimentellen PLA selbst bei einer 10-fach höheren Verdünnung von GFP- und FLAG-Antikörpern noch deutlich unterschiedlich; die Gesamtdichte und die durchschnittliche Größe der Brennpunkte wurden jedoch verringert (Tabelle 1).
Abbildung 1: Schematische sederin C. elegans. Der distale Spitzenbereich enthält den Stammzellpool, dem meiotisches Pachyten folgt, wo die Zellen von Mitose zu Meiose gewechselt sind. Zellen, die das meiotische Pachyten verlassen, entwickeln sich zu Eizellen, mit der ausgereiftesten Eizelle am proximalen Ende. Die grün schattierte Region, die sich vom späten meiotischen Pachyten bis zu allen Eizellen erstreckt, stellt das OMA-1-Muster des Ausdrucks dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder des Workflows für die Keimbahn PLA-Quantifizierung. Die in dieser Abbildung verwendete Keimbahn ist eine repräsentative 3xFLAG::DLC-1; GFP-Keimbahn aus Abbildung 3C. (A) Bild der zusammengeführten PLA- und DAPI-Kanäle, die in FIJI/ImageJ geöffnet wurden. (B) Das Polygonwerkzeug in FIJI wird verwendet, um den Interessenbereich (ROI) in der geraifkenden Keimbahn (gelbe Linie mit weißen Feldern) zu skizzieren und zu definieren, und die Fläche des ROI (M2) wird gemessen (Einset von B). (C) Ein einzelnes Bild des PLA-Kanals wird durch Duplizieren oder Aufteilen des Originalbildes in (A,B) erhalten. (D) Der Schwellenwert ist sorgfältig so eingestellt, dass alle PLA-Brennpunkte im PLA-Bild deutlich hervorgehoben werden. Derselbe Schwellenwert muss auf alle Versuchs- und Kontrollbilder angewendet werden, die zusammen analysiert werden. (E) Wenn der ROI im Schwellenwertbild ausgewählt ist, gibt die Funktion Partikel analysieren eine Tabelle mit Ergebnissen zurück, die die Gesamtanzahl der im ROI enthaltenen Brennpunkte enthält (Einset von E). Bilder sind Schnappschüsse von FIJI/Bild J: Plugins | Dienstprogramme | Capture Image. Skalenbalken = 10 M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von Keimbahnen nach Co-Immunostaining oder PLA. (A,B) Die Expressionsmuster von markierten Proteinen in 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) wurden in sezierten, fixierten und immunbefleckten Gonaden bewertet. Anti-FLAG-Antikörper wurde bei einer Verdünnung von 1:1000 verwendet, während Anti-GFP-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 verwendet wurde, was für Immunfluoreszenzbilder optimal ist. DNA wurde von DAPI gebeizt, und der einzelne Kanal wird in Graustufen für einen besseren Kontrast gezeigt (Aiv,Biv). In jedem Bild werden die Stammzellen und meiotischen Pachyten mit gestrichelten Linien umrissen, während die Eizellen mit gepunkteten Linien umrissen sind. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Skalenstäbe = 10 M. (C,D) PLA in extrudiert3xFLAG::DLC-1; GFP (C) und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) Gonaden. Anti-FLAG-Antikörper wurde bei einer Verdünnung von 1:1000 verwendet, während Anti-GFP-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:4000 verwendet wurden. DNA wurde von DAPI gebeizt, und sowohl die einzelnen DAPI (Cii,Dii) als auch DIE PLA-Kanäle (Ciii,iv, Diii,iv) werden in Graustufen für einen besseren Kontrast dargestellt. Das grüne, gestrichelte Feld (Ciii,Diii) bezeichnet die Position der vergrößerten PLA-Bilder (Civ,Div). In jedem Bild werden die Stammzellen und meiotischen Pachyten mit gestrichelten Linien umrissen, während die Eizellen mit gepunkteten Linien umrissen sind. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Skalenstäbe = 10 M. (A,B,C,D) wurden alle mit Bildverarbeitungssoftware montiert (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Antikörperverdünnung | Dehnung getestet | Durchschnittliche PLA-Dichte (brennpunkte/22) X 10-2 | T-Test | Durchschnittliche Größe der PLA Foci (M2) | T-Test |
| -FLAG (1:1000), GFP (1:4000) | 3xFLAG::DLC-1; GFP | 3,9 x 1,4 | P = 1,917E-05 | 0,52 € 0,127 | P = 0,057 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 9,1 bis 2,7 | 1,8 x 2,08 | |||
| -FLAG (1:10.000), GFP (1:40.000) | 3xFLAG::DLC-1; GFP | 3,2 x 2,4 | P = 3.395E-04 | 0,51 x 0,1 | P = 0,019 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 7,7 x 3 | 0,7 x 0,24 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der PLA-Ergebnisse. Tabelle, die eine Zusammenfassung der PLA-Quantifizierung bei zwei Verdünnungen des primärantikörpers enthält. Die Unterschiede in der durchschnittlichen PLA-Dichte oder der durchschnittlichen Größe der PLA-Brennpunkte für OMA-1::GFP zwischen beiden Antikörpertitrationen waren nicht signifikant (p-Wert nicht dargestellt). Derselbe Vergleich wurde auch auf das GFP angewandt, was auch zu keinen signifikanten Unterschieden führte (p-Wert nicht dargestellt). Die p-Werte wurden mit einem zweischwanzigen/gleichen Varianz-t-Testermittelt.
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Discussion
Bei der Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn ermöglicht die höhere Auflösung, die PLA im Vergleich zur Co-Immunostainierung bietet, die Visualisierung und Quantifizierung von Orten, an denen Wechselwirkungen in der Keimbahn auftreten. Es wurde zuvor berichtet, dass DLC-1 direkt mit OMA-1 interagiert, indem ein in vitro GST Pulldown-Assay26verwendet wird; Diese Wechselwirkung wurde jedoch nicht durch einen In-vivo-Pulldown wiederhergestellt. Die fluoreszierende Co-Immunostainierung von 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-Keimlinien zeigen eine Überlappung in den Expressionsmustern für DLC-1 und OMA-1; es gibt jedoch keinen Hinweis darauf, wo ihre Wechselwirkungen in der Keimbahn auftreten, und die Überlappung selbst ist nicht größer als die zwischen 3xFLAG::DLC-1 und GFP, die nicht mit einem Protein verschmolzen ist (negative Kontrolle). Mit In-situ-PLA wurde festgestellt, dass DLC-1 mit OMA-1 in der Keimbahn interagiert, was darauf hindeutet, dass PLA für den Nachweis von PPI im Vergleich zu anderen Ansätzen empfindlicher sein könnte. Durch diesen Ansatz erweitern wir die sich abzeichnende Rolle von DLC-1 als RBP-Kofaktor weiter. Diese Arbeit zeigt die Fähigkeit von PLA, PPIs in der Keimbahn zu erkennen und legt eine Referenz für zukünftige Anwender fest, die die Wechselwirkungen zwischen Proteinen ihres eigenen Interesses untersuchen.
PLA bietet Anwendern die Möglichkeit, ppIs mit vergleichbarer Empfindlichkeit ohne die Nachteile anderer Techniken wie FRET und BiFC zu testen. Biologisch relevante Proteinexpressionen sind für FRET und BiFC möglicherweise nicht optimal. Außerdem kann die Funktion potenzieller Interaktionspartner durch die großen Tags beeinflusst werden, die in beiden Ansätzen verwendet werden. Darüber hinaus erfordern FRET-Assays eine spezielle Mikroskopieeinrichtung, die möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar ist. PLA kann auch ein kostengünstiger Ansatz sein, um PPI im Vergleich zu anderen Techniken zu untersuchen. Anwender benötigen nur PLA-Reagenzien und Zugang zu einem konfokalen Mikroskop für die Bildgebung zusätzlich zu den Reagenzien, die für die Immunfärbung benötigt werden. Die Bildanalyse wird mit dem Open-Source-Programm FIJI/ImageJ durchgeführt, das jedem Benutzer kostenlos zur Verfügung steht. Benutzer, die keine Erfahrung mit FRET oder BiFC haben, finden PLA möglicherweise als geeignete Alternative. Das hier vorgestellte Protokoll enthält nur einige zusätzliche Schritte, die über ein typisches Immunostaining-Verfahren hinausgehen, wodurch diese Technik für jeden Benutzer mit Immunostaining-Erfahrung praktisch zugänglich ist.
Die Extrusion des Gonaden durch Sezieren ist wichtig für PLA, um erfolgreich zu arbeiten. Gewebe, die innerhalb der Wurmhaut zurückgehalten werden, werden von PLA nicht mit diesem Protokoll beschriftet. Es wurde ferner festgestellt, dass extrudierte Embryonen durch dieses PLA-Protokoll wirksam gekennzeichnet sind. Dies deutet darauf hin, dass andere Gewebe, die während der Zerlegung freigesetzt werden, wie der Darm, wahrscheinlich auch mit PLA kompatibel sind. Es wurde festgestellt, dass PLA robuste Signale auf Gonaden sowie Embryoproben produziert, die mit zwei Fixierungsprotokollen hergestellt werden, die häufig für die Immunfärbung verwendet werden. Dies deutet darauf hin, dass zusätzliche Fixierungsverfahren, die in diesem Feld verwendet werden, möglicherweise mit PLA kompatibel sind, aber vom Benutzer einzeln bewertet werden müssen.
Die Bestimmung der optimalen Verdünnung primärer Antikörper ist entscheidend für eine erfolgreiche PLA. Es ist am besten, mit der Verdünnung zu beginnen, die für Die Immunfluoreszenz optimiert wurde. Dies wird in der Regel durch Tittiern des primären Antikörpers in einem Immunfluoreszenzexperiment erreicht, um die optimale Verdünnung zu finden, wo es einen niedrigen Hintergrund und ein hohes, spezifisches Signal gibt. Sobald die optimalen Verdünnungen für die Immunfluoreszenz festgestellt wurden, können dieselben Verdünnungen in einem PLA-Assay getestet werden, der das Signal eines Paares potenzieller Interaktoren mit dem Signal vergleicht, das von einem Kontrollpaar nicht interagierender Proteine erzeugt wird.
In dem Fall, in dem reichliches Signal in der Kontrollprobe beobachtet wird, ist eine weitere Verdünnung der primärantikörper erforderlich. Es wurde festgestellt, dass die optimalen primären Antikörperverdünnungen für PLA mindestens gleich oder sogar verdünnter sind als das, was für die Immunfluoreszenz verwendet wird. Beispielsweise sind Immunfluoreszenzbilder in Abbildung 3A,B repräsentativ für eine Verdünnung von Anti-FLAG 1:1000 und eine Verdünnung von Anti-GFP von 1:200. Die Antikörperverdünnungen in PLA-Bildern in Abbildung 3C,D waren jedoch 1:1000 Anti-FLAG und 1:4000 Anti-GFP. Die Verdünnung von Anti-GFP-Antikörpern, die in PLA verwendet werden, ist größer als das, was für die Immunfluoreszenz verwendet wurde, was darauf hindeutet, dass PLA viel empfindlicher ist. Es wurde festgestellt, dass verdünnende Antikörper um das Zehnfache zu einer Verringerung der PLA-Dichte sowie der Größe der DLC-1/OMA-1-Brennpunkte führten (Tabelle 1). Trotz dieser Reduktion war der Unterschied in der PLA-Dichte zwischen der Negativkontrolle und DLC-1/OMA-1 noch deutlich anders. Dies deutet darauf hin, dass PLA immer noch sehr empfindlich mit höheren Verdünnungen von primärer Antikörper ist; die Prävalenz nachweisbarer Wechselwirkungen wird jedoch unterschätzt.
Im Gegensatz dazu kann eine zu geringe Verdünnung von Antikörpern zwei Arten von schädlichen Folgen haben. Erstens kann es ein signifikantes Hintergrundsignal in der Negativkontrolle erzeugen. Zweitens könnten PLA-Brennpunkte, die von den interagierenden Partnerproteinen erzeugt werden, verschmelzen und sich überlappen, was sie schwierig macht, sie in einem maximalen Projektionsbild aufzulösen. Dies führt zu einer Unterschätzung der PLA-Foci-Zahl und -Dichte während der Bildanalyse. DAS PLA-Signal ist ein Gleichgewicht zwischen der Erkennung der falschen Nähe zwischen nicht interagierenden Partnern und der Erkennung jeder Instanz realer PPIs, die in der Stichprobe auftreten. Infolgedessen ist die Einbeziehung einer negativen Kontrolle, bei der zwei Proteine nicht interagieren, für die Bestimmung des Hintergrundniveaus in PLA-Experimenten unerlässlich. Das Auslassen eines primären Antikörpers in einem PLA-Experiment wurde in anderen Berichten9,10als Negativkontrolle verwendet; Dieser Ansatz kann jedoch keine unspezifischen Wechselwirkungen oder unspezifische Antikörperbindung berücksichtigen, die sich auf das Ergebnis der experimentellen PLA auswirken können. GFP wurde hier als Negativkontrolle verwendet, da keine direkte Interaktion zwischen DLC-1 und GFP erwartet wurde. Es wurde festgestellt, dass die negative Kontrolle ein Hintergrundsignal hatte. Dies unterstreicht auch die Bedeutung einer Negativkontrolle für einen PLA-Test bei der Auswertung der experimentellen Daten.
Sobald PLA-optimierte Verdünnungen festgelegt sind, können diese Verdünnungen verwendet werden, um über ein Array verschiedener Wurmstämme zu testen, die verschiedene Paare von Interaktionspartnern enthalten, die mit den gleichen Affinitäts-Tags markiert sind. Es ist wichtig, das gleiche Paar primärer Antikörper zu verwenden, um einen fairen Vergleich der resultierenden PLA-Signale zu gewährleisten, da Variationen in der Antikörperaffinität das Ergebnis eines PLA-Experiments beeinflussen können. Ein weiterer Bericht über PLA schlägt vor, die Verdünnung der PLA-Sekundärantikörper10zu optimieren; Dies wird jedoch nicht empfohlen. Höhere Verdünnungen von sekundären Antikörpern können die Wirksamkeit der anderen nachgeschalteten PLA-Schritte verringern, die von der Erkennung von PLUS- und MINUS-Sonden abhängen, die mit den sekundären Antikörpern konjugiert sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Einige Nematodenstämme, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Caenorhabditis Genetics Center bereitgestellt, das von der NIH (P40OD010440) finanziert wurde. Die konfokale Mikroskopie wurde im BioSpectroscopy Core Research Laboratory der University of Montana durchgeführt, das mit Unterstützung der NIH Awards P20GM103546 und S10OD021806 betrieben wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch das NIH-Stipendium GM109053 an E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 an X.W. und Montana Academy of Sciences Award an X.W. unterstützt. Die Geldgeber waren weder an der Studiengestaltung noch am Verfassen des Berichts beteiligt. Wir danken Herrn Ellenbecker für die Diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4x8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Nooren, I. M., Thornton, J. M.
- Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H.
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
- Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
- Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
- Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
- Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
- Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
- Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
- Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
- Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
- Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
- Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
- Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
- Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
- Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
- Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).
