عزل Myofibrils من خزعات العضلات والهيكل العظمي وتحديد وظيفة المتعاقدة مع نانو نيوتن القرار نقل الطاقة
Summary
قدم هنا هو بروتوكول لتقييم خصائص العقد من myofibrils العضلات المتصدع مع قرار نانو نيوتن. يستخدم البروتوكول إعدادًا باستخدام مسبار قوة بصري قائم على التداخل. هذا الإعداد يولد البيانات مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء وتمكن من تقييم الحركية العقدية من myofibrils.
Abstract
خلايا العضلات المُتَمَرّسة لا غنى عنها لنشاط البشر والحيوانات. تتكون ألياف العضلات المفردة من myofibrils ، والتي تتكون من الساركوميريات المرتبطة بشكل متسلسل ، أصغر وحدات التقلص في العضلات. يساهم الخلل الاختيائي الساركميري في ضعف العضلات لدى المرضى الذين يعانون من طفرات في ترميز الجينات للبروتينات الساركية. دراسة ميكانيكا myofibril يسمح لتقييم التفاعلات actin-myosin دون آثار الخلط المحتملة من التالفة، الميوفيبرليس المجاورة عند قياس قابلية ألياف العضلات واحدة. قد يسهم الضرر الفائق البنية واتّصال الميوفي في إعاقة التقلص. إذا كان الضرر الهيكلي موجود في myofibrils، فإنها من المرجح أن كسر أثناء إجراء العزل أو أثناء التجربة. وعلاوة على ذلك، توفر الدراسات في myofibrils تقييم التفاعلات actin-myosin في وجود القيود الهندسية من الساركوميريات. على سبيل المثال، يمكن أن توضح القياسات في myofibrils ما إذا كان الخلل في myofibrillar هو التأثير الأساسي لطفرة في البروتين الساركيري. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التسريب مع حلول الكالسيوم أو المركبات هو فوري تقريبًا بسبب القطر الصغير للميوفيريبريل. وهذا يجعل myofibrils مناسبة بشكل بارز لقياس معدلات التنشيط والاسترخاء أثناء إنتاج القوة. البروتوكول الموصوف في هذه الورقة يستخدم مسبار قوة بصرية على أساس مبدأ مقياس التداخل فابري-بيرو قادر على قياس القوى في نطاق نانو نيوتن، إلى جانب محرك طول بيزو ونظام الضخ السريع الخطوة. هذا الإعداد تمكن من دراسة الميكانيكا myofibril مع قياسات قوة عالية الدقة.
Introduction
خلايا العضلات المُرَقّلة لا غنى عنها لأنشطة الحياة اليومية. حركة الأطراف، وظيفة الجهاز التنفسي، وحركة ضخ القلب تعتمد على القوة التي تولدها خلايا العضلات. العضلات الهيكلية تتكون من كراسات العضلات التي تحتوي على حزم من ألياف العضلات الفردية (الشكل 1A). تتكون هذه الألياف العضلية من myofibrils ، والتي تتكون من الساركوميريات المرتبطة بشكل متسلسل (الشكل 1B ، D). تحتوي الساركوميريات على خيوط رقيقة وسميكة. هذه تتكون في المقام الأول من سلاسل من جزيئات actin و myosin ، على التوالي (الشكل 1B). Actin-myosin التفاعلات هي المسؤولة عن القدرة على توليد القوة من العضلات. المرضى الذين يعانون من طفرات في ترميز الجينات للبروتينات الساركية، مثل النيبولين، actin، وتروبونين تي، يعانون من ضعف العضلات بسبب خلل الوظيفي1انكماشية .
يمكن دراسة نوعية العضلات العقدية على مختلف مستويات التنظيم, بدءا من في العضلات الكاملة في الجسم الحي إلى التفاعلات actin-myosin في مقايسات الحركة في المختبر. خلال العقود الماضية، وضعت العديد من مجموعات البحث الاجهزة لتحديد قابلية الفردية myofibrils2،3،4،5،6،7،8،9،10. وتستند هذه الاجهزة على الكشف عن التغيرات في انحراف الليزر من cantilever (أي انحراف شعاع البصرية) الناجمة عن تقلص myofibril (للحصول على التفاصيل، انظر لابودا وآخرون11). على الرغم من أن تحديد وظيفة العقد من myofibrils لديه بعض القيود (على سبيل المثال ، فإن ديناميات عمليات اقتران الإثارة والانكماش التي هي في المنبع من myofibrils تفتقر) ، وهناك مزايا متعددة لهذا النهج. وتشمل هذه: 1) القدرة على تقييم التفاعلات actin-myosin في وجود القيود الهندسية من الساركوميريات; 2) القدرة على تقييم التفاعلات actin-myosin دون آثار مربكة محتملة من التالفة، ميوسل المجاورة (عند قياس قابلية التقلص من ألياف العضلات واحدة تلف ultrastructural وسوء محاذاة myofibrils قد تسهم في ضعف قابلية) (الشكل 1D); 3) قطر صغير من myofibrils (~ 1 ميكرومتر، الشكل 2A)وعدم وجود أغشية تسمح لنشر الكالسيوم فورية تقريبا في ساركوميريس. وعلاوة على ذلك، إذا كان الضرر الهيكلي موجود في myofibrils، فإنها من المرجح أن كسر أثناء عزلتهم أو أثناء التجربة. وبالتالي، تقييم العقد myofibril هو طريقة أنيقة لدراسة الآليات الأساسية لتقلص العضلات وفهم ما إذا كانت التفاعلات actin-myosin المضطربة هي السبب الرئيسي لأمراض العضلات الناجمة عن الطفرات في البروتينات الساركية.
هذا البروتوكول يقدم الإعداد وضعت حديثا لتحديد قابلية myofibrils دمجها في الكوتليف قوة التحقيق مع نانو نيوتن القرار (أي Optiforce). ويستند هذا التحقيق قوة على مبدأ قياس التداخل. يمكن قياس التداخل استخدام الكناتليف شديدة نسبيا. وهذا يجعل من الممكن لقياس القوة مع انحراف قليلا من cantilever، تقترب من تقلصات متساوي القياس من myofibril. يسمح المسبار بتقييم القوى السلبية والنشطة المنخفضة التي تنتجها myofibril واحدة معزولة عن خزعات العضلات المختلفة ، بما في ذلك تلك من البشر ، مع نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. ويستند البصرية cantilever قوة التحقيق المدرجة في هذا الإعداد على مقياس التداخل Fabry-Pérot12. جهاز قياس التداخل يكشف النزوح صغيرة بين الألياف البصرية و cantilever المغلفة بالذهب التي شنت على ضراوة(الشكل 3). وتسمى الفجوة بين الألياف البصرية و cantilever تجويف فابري-Pérot. يتم تركيب Myofibrils بين المسبار والمحرك بيزو باستخدام اثنين من الألياف الزجاجية المغلفة الغراء. يمكن أن تستمد القوة التي تنتجها myofibril رياضيا من البيانات التداخل. ويستند قياس التداخل على تراكب أو تدخل اثنين أو أكثر من موجات (في هذا الإعداد ثلاث موجات ضوئية). ينبعث ضوء الليزر مع الطول الموجي بين 1,528.77-1,563.85 نانومتر من مقياس التداخل ويتم إرسالها من خلال الألياف البصرية. في التحقيق، ينعكس الضوء 1) في الواجهة بين الألياف البصرية والمتوسطة(الشكل 3A)؛ 2) في واجهة من الوسط و cantilever (الشكل 3B); و 3) في واجهة بين طلاء المعادن والذهب من cantilever (الشكل 3C). يعتمد الانعكاس في الواجهة A و B على مؤشر الانكسار(n)للوسيلة التي يتم فيها غمر المسبار. يعود الضوء، الذي يتكون من الانعكاسات الثلاثة فوقها، إلى الصمام الضوئي في مقياس التداخل. يقيس الصمام الضوئي شدة الضوء ، والذي هو نتيجة لنمط التداخل للانعكاسات الثلاثة فوقها. عندما يتم إنشاء قوة المتعاقدة عن طريق تفعيل أو تمتد myofibril، ويسحب myofibril على cantilever. هذه الحركة يغير حجم تجويف (د ) ، وبالتالي ، فإن عدد من الأطوال الموجية التي تناسب في تجويف. وسيكون للضوء المنعوت في الـ cantilever مرحلة مختلفة، مما يؤدي إلى نمط تداخل مختلف. يسجل الصمام الضوئي هذا التغيير في كثافة نمط التداخل كتغيير في فولت. في وقت لاحق، يتم حساب توليد قوة myofibril من هذا التغيير، مع الأخذ في الاعتبار صلابة cantilever. يتم معايرة التحقيق قوة من قبل الشركة المصنعة عن طريق دفع غيض من إبرة تصاعد، تعلق على نهاية تسليم الحرة من cantilever، ضد مقياس وزنها مع الحفاظ على الانحناء من cantilever يساوي مضاعف من الطول الموجي لليزر قراءة13. وبالتالي، فإن قياس التداخل هو طريقة حساسة للغاية للكشف عن التغيرات الصغيرة في المسافة، مما يسمح بقياس القوى بدقة نانو نيوتن. هذا القرار يتيح تقييم إنتاج قوة myofibrillar مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء. في حين أن قياس التداخل التقليدي يحد من نطاق القياسات إلى الجزء الخطي من منحنى التداخل ، فإن استخدام مكبر للصوت وتأمين وتعديل الطول الموجي بالليزر يتغلب على هذا القيد14. يتم شرح ذلك بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة.
لقياس التوتر الفعال myofibril ، تم دمج نظام الضخ السريع خطوة لفضح myofibril إلى حلول الكالسيوم (الشكل 4A). يتيح نظام الضخ السريع للخطوة تغييرات الحل في غضون 10 مللي ثانية. بسبب قطرها الصغير ، وانتشار الكالسيوم في myofibrils هو فوري تقريبا. وبالتالي، هذا النظام هو مناسبة خاصة لقياس معدلات actin-myosin ملزمة أثناء التنشيط والافراج أثناء الاسترخاء. يمكن تحديد معدل التنشيط (kACT)والاسترخاء (kREL)من منحنيات التنشيط والاسترخاء. أيضا، من خلال تعريض myofibrils لمحلول الكالسيوم من زيادة التركيز، يمكن تحديد العلاقة قوة الكالسيوم وحساسية الكالسيوم.
وعلاوة على ذلك، محرك طول بيزو تمكن تمتد بسرعة وتقصير من myofibril. وهذا يوفر إمكانية لدراسة خصائص viscoelastic (أي التوتر السلبي) من myofibril، فضلا عن أداء تقصير سريع ومرح من myofibril لتحديد معدل إعادة تطوير التوتر (كTR). يمكن تغيير المعلمات التي تم استردادها من تجارب التوتر النشط والسلبي على حد سواء عن طريق الطفرات الجينية في البروتين الساركيري.
تم استخدام هذا الإعداد المخصص لقياس الخصائص المتعاقدة النشطة والسلبية لـ myofibrils المعزولة عن العضلات العظمية البشرية والصحية والمريض والفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هو بروتوكول لتقييم وظيفة العقد من myofibrils معزولة عن أنسجة العضلات الهيكل العظمي البشري أو الحيوانية. وقد تم وصف قرار القوة لهذا الإعداد من قبل Chavan وآخرون12. باختصار ، يتم تحديدها من خلال التقلبات العشوائية لطول تجويف Fabry-Pérot التي تشكلت بين ألياف الكشف و cantilever ، والتي تنتج الج?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من قبل AFM-Telethon وقوة بناء مؤسسة لـ Nemaline Myopathies. يرغب المؤلفان في الإشادة بمبتكر المنتجات المذكورة في هذه المقالة، IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Riferimenti
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
