Изолировать миофибрили от биопсии скелетных мышц и определения контрактильной функции с помощью нано-ньютоновского разрешения силы трансдуцера
Summary
Здесь представлен протокол для оценки контрактильные свойства полосатых мышечных миофибриллей с нано-ньютоновым разрешением. Протокол использует установку с интерферометрией на основе, оптический зонд силы. Эта установка генерирует данные с высоким соотношением сигнала к шуму и позволяет оценить контрактильной кинетики миофибрил.
Abstract
Полосатые мышечные клетки незаменимы для активности человека и животных. Одиночные мышечные волокна состоят из миофибрил, которые состоят из последовательно связанных саркомеров, самых маленьких контрактильные единицы в мышцах. Саркомерная дисфункция способствует мышечной слабости у пациентов с мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки. Изучение механики миофибриля позволяет оценить актин-миозин взаимодействия без потенциального путаницы эффекты поврежденных, смежных миофибрил при измерении контрактности одного мышечного волокна. Ультраструктурное повреждение и несогласованность миофибрил может способствовать нарушению контрактности. Если структурные повреждения присутствуют в миофибрилях, они, вероятно, ломаются во время процедуры изоляции или во время эксперимента. Кроме того, исследования в миофибрилях дают оценку актин-миозин взаимодействий в присутствии геометрических ограничений саркомеров. Например, измерения в миофибрилях могут выяснить, является ли дисфункция миофибриллярной является основным следствием мутации в саркомерных белках. Кроме того, перфузия с растворами кальция или соединений почти мгновенно из-за малого диаметра миофибриля. Это делает миофибриль в высшей степени подходящим для измерения темпов активации и релаксации во время силового производства. В протоколе, описанном в настоящем документе, используется оптический силовой зонд, основанный на принципе интерферометра Фабри-Перо, способного измерять силы в диапазоне нано-ньютона, в сочетании с двигателем длины пьезо и быстроступной системой перфузии. Эта установка позволяет изучать механику миофибриля с высоким разрешением измерения силы.
Introduction
Полосатые мышечные клетки незаменимы для повседневной жизни. Движение конечностей, дыхательная функция и насосное движение сердца зависят от силы, генерируемой мышечными клетками. Скелетная мышца состоит из мышечных фасциклов, содержащих пучки одиночных мышечных волокон(рисунок 1A). Эти мышечные волокна состоят из миофибрил, которые образуются последовательно связанных саркомеров (Рисунок 1B,D). Саркомеры содержат тонкие и толстые нити. Они в основном состоят из цепей молекул актина и миозин, соответственно (Рисунок 1B). Взаимодействия Актин-миозин отвечают за силу генерирующей способности мышц. Пациенты с мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки, такие как небулин, актин и тропонин Т, страдают мышечной слабостью из-за контрактнойдисфункции 1.
Качество мышечной контрактности можно изучать на различных уровнях организации, начиная от in vivo целые мышцы для актин-миозин взаимодействия в пробирке подвижности анализов. За последние десятилетия несколько исследовательских групп разработали установки для определения контрактности отдельныхмиофибрил 2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10. Эти установки основаны на обнаружении изменений в лазерном отклонении от кантилевера (т.е. оптического отклонения пучка), вызванного сокращением миофибриля (подробнее см. Labuda et al.11). Хотя определение контрактной функции миофибриля имеет некоторые ограничения (например, динамика процессов соединения возбуждения и сокращения, которые находятся вверх по течению от миофибрил, отсутствуют), есть несколько преимуществ этого подхода. К ним относятся: 1) способность оценивать актин-миозин взаимодействия в присутствии геометрических ограничений саркомеров; 2) способность оценивать актин-миозин взаимодействия без потенциального путаницы эффекты поврежденных, смежных миофибрил (при измерении контрактности одной мышцы волокон ультраструктурного повреждения и несогласованности миофибрил может способствовать нарушению контрактности) (Рисунок 1D); 3) малый диаметр миофибринов (1 мкм, рисунок 2A) и отсутствие мембран позволяют почти мгновенное распространение кальция в саркомеры. Кроме того, если структурные повреждения присутствуют в миофибрилях, они, вероятно, ломаются во время их изоляции или во время эксперимента. Таким образом, оценка миофибриль контрактности является элегантным методом для изучения основных механизмов сокращения мышц и понять, являются ли нарушенные актин-миозин взаимодействия являются основной причиной мышечных заболеваний, вызванных мутациями в саркомерных белков.
Этот протокол представляет собой недавно разработанную установку для определения контрактности миофибриллов, включающих силовой зонд кантилевера с нано-ньютоновским разрешением (т.е. Optiforce). Этот силовой зонд основан на принципе интерферометрии. Интерферометрия позволяет использовать относительно жесткие кантилеверы. Это позволяет измерить силу с небольшим отклонением кантилевера, приближаясь к изометрическим сокращениям миофибриля. Зонд позволяет оценить низкие пассивные и активные силы, которые производятся одним миофибрилем, изолированным от различных биопсий мышц, в том числе от человека, с высоким соотношением сигнала к шуму. Оптический силовой зонд кантилевера, включенный в эту установку, основан на интерферометреФабри-Перо 12. Интерферометр обнаруживает небольшие смещения между оптическим волокном и позолоченным кантилевером, установленным на ферруле(рисунок 3). Зазор между оптическим волокном и кантилевером называется полостью Фабри-Перот. Миофибрили устанавливаются между зондом и пьезо-мотором с использованием двух стеклянных волокон, покрытых клеем. Сила, производимая миофибрилем, может быть математически получена из данных интерферометра. Интерферометрия основана на суперпозиции или вмешательстве двух или более волн (в этой установке три световые волны). Лазерный свет длиной волны от 1528,77 до 1563,85 нм излучается из интерферометра и направляется через оптическое волокно. В зонде свет отражается 1) на стыке оптического волокна и среды(рисунок 3A); 2) на интерфейсе среды и кантилевера(рисунок 3B); и 3) на стыке металлического и золотого покрытия кантилевера(рисунок 3C). Отражение в интерфейсе А и В зависит от рефракционногоиндекса (n)среды, в которую погружается зонд. Свет, состоящий из трех наложенных отражений, возвращается к фотодиоду в интерферометре. Фотодиод измеряет интенсивность света, что является результатом интерференционной картины трех наложенных отражений. Когда контрактная сила генерируется путем активации или растяжения миофибриля, миофибриль тянет на кантилевер. Это движение изменяет размер полости(d) и, следовательно, количество длин волн, которые вписываются в полость. Свет, отраженный в кантилевере, будет иметь другую фазу, что приведет к другой схеме помех. Фотодиод записывает это изменение интенсивности интерференционной модели как изменение Вольтов. Впоследствии, myofibril силовой генерации рассчитывается из этого изменения, с учетом жесткости кантилевера. Силовой зонд откалиброван производителем, нажав кончик монтажной иглы, прикрепленный к свободной передаче конца кантилевера, против весовой шкалы, сохраняя при этом изгиб кантилевера, равный кратной длине волны лазерасчитывания 13. Таким образом, интерферометрия является весьма чувствительным методом обнаружения небольших изменений расстояния, позволяющим измерять силы с нано-ньютоновым разрешением. Это разрешение позволяет оценить производство миофибрилляции с высоким соотношением сигнала к шуму. В то время как традиционная интерферометрия ограничивает диапазон измерений линейной частью кривой интерференции, используя усилитель блокировки и модуляцию длины волны лазера,преодолевает это ограничение 14. Это более подробно описано в разделе обсуждения.
Для измерения миофибриля активного напряжения, быстро шаг перфузии система была включена подвергать миофибриля кальция решений(рисунок 4A). Система быстрой перфузии позволяет вносить изменения в раствор в пределах 10 мс. Из-за их малого диаметра, диффузии кальция в миофибриль почти мгновенно. Следовательно, эта система особенно подходит для измерения скорости связывания актин-миозин во время активации и высвобождения во время релаксации. Скорость активации (kACT) и релаксации (kREL) может быть определена по кривым активации релаксации. Кроме того, подвергая миофибрилляции кальция решения повышения концентрации, сила кальция отношения и чувствительность кальция может быть определена.
Кроме того, двигатель длины пьезо позволяет быстро растягиваться и сокращать миофибриль. Это дает возможность изучить вязко-вязкие свойства (т.е. пассивное напряжение) миофибриля, а также выполнение быстрого сокращения и рестайка миофибриля для определения скорости редевелопмента напряжения (kTR). Параметры, извлеченные из экспериментов с активным и пассивным напряжением, могут быть изменены генными мутациями в саркомерном белке.
Эта специально созданная установка была использована для измерения активных и пассивных контрактильные характеристики миофибрил, изолированных от здоровых человеческих, терпеливых и мышиных скелетных мышц.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан протокол для оценки контрактильной функции миофибрил, изолированных от человеческих или животных скелетных мышечных тканей. Силовое разрешение этой установки было описано ранее Chavan et al.12. Короче говоря, это определяется случайными колебаниями длины полости Фабри-?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался AFM-Telethon и Фондом «Строительная сила для Немалин Миопати». Авторы хотели бы отметить создателя продуктов, упомянутых в этой статье, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
Riferimenti
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
