P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양
Summary
당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.– 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.
Abstract
f폐감염의 치료를 위한 약물 연구는 높은 복잡성의 시험관 내 모델을 향해 진행되고 있다. 폐 모형에 있는 박테리아의 다각적인 존재는 면역 세포가 마이크로 환경에서 박테리아에 대하여 선동적인 반응을 조정하는 동안 상피 배열을 재적응할 수 있습니다. 생체 내 모델은 낭포성 섬유증의 맥락에서 새로운 항 감염제를 테스트하기위한 선택이지만, 그들은 여전히 인간과 치료 결과에 그러한 질병의 생체 내 상태를 정확하게 모방하지 않습니다. 인간 세포 (기관지 상피 및 대식세포)와 관련 병원체에 기초한 감염된 기도의 복잡한 시험관 내 모형은 이 간격을 다리를 내고 진료소로 새로운 항 감염제의 번역을 용이하게 할 수 있었습니다. 이러한 목적을 위해, 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및– THP-1 단낭세포 유래 대식세포의 공동 배양 모델이 설립되어 공기 액체 인터페이스(ALI) 조건에서 P. aeruginosa에 의한 인간 기관지 점막의 감염을 모방하였다. 이 모델은 7 일 안에 설정되며, 다음과 같은 매개 변수는 동시에 평가됩니다 : 상피 장벽 무결성, 대식 세포 간 변형, 세균 생존 및 염증. 본 프로토콜은 새로운 항 감염제를 발견하고 폐에 에어로졸 납품을 최적화하는 것과 관련이 있을 수 있는 약물 효능 및 호스트 반응을 평가하기 위한 견고하고 재현 가능한 시스템을 설명합니다.
Introduction
슈도모나스 아에루기노사는 낭포성 섬유증(CF)의 관련 병원체로 폐 조직 장애1에기여한다. 알자네이트 및 기타 점액 외극성 과 같은 다당류의 생산은, 끈질긴 세균 준수로 이끌어 내는 질병의 진행을 조정하고, 박테리아에 대한 항생제의 전달을 제한하고 숙주 면역 계통에 대하여 박테리아를 보호합니다2. 판자에서 생물막 형성으로의 P. aeruginosa의 전환은 이러한 맥락에서 중요한 문제이며, 또한 항생제 내성의 발생을 용이하게합니다.
CF의 맥락에서 마우스는 주로 모델로 사용되었습니다. 마우스는, 그러나, CF 돌연변이3의도입과 함께 자발적으로 이 질병을 개발하지 않는다. 대부분의 세균성 생물막 개발 및 약물 감수성 연구는 페트리 접시와 같은 무생물 표면에서 수행되었습니다. 그러나 이 방법은 생체 내 복잡성을 나타내지는 않습니다. 예를 들면, 중요한 생물학 장벽은 면역 세포 뿐만 아니라 점막 상피를 포함하여 결석합니다. P. aeruginosa는 상피 세포에 아주 유독하더라도, 몇몇 단은 인간 기관지 세포와 이전 P. aeruginosa 생물막을 공동 경작하는 것을 관리했습니다. 이들 세포는 CFTR 돌연변이(CFBE41o-세포)를 가진– 낭포성4 섬유증 환자로부터 유래하고 항생제 효능5을 평가하거나 감염6시 CFTR 단백질의 교정을 평가할 수 있었다. 이러한 모델은 약물 개발7의 후기 단계에서 실패한 약물문제의 특성화를 가능하게 하는 것 외에도 약물 효능의7예측 가능성을 향상시키는 것으로 나타났다.
그러나 폐에서는 점막 상피가 공기에 노출됩니다. 더욱이, 기도에 존재하는 면역 세포는 조직 대식세포같이, 흡입한 병원체 또는 입자에 대하여 필수적인 역할을합니다 8. 대식세포는 기관지 루멘에 도달하고 감염을 싸우기 위하여 다른 세포 층을 통해 이동합니다. 더욱이, 흡입된 약은 또한 폐 공기-혈액 장벽9의추가 비세포 원소로서 점액의 존재에 대처해야 한다. 실제로 생체 외 모델의 복잡한 3차원(3D)이 개발되어 생체 내 관련성을 높이는 것을 목표로 하고 있다. 공동 배양 시스템은 약물 발견을 위한 체외 시스템의 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다. 이러한 복잡성은 대식세포이동(10),호중구(11)에의한 항균 펩티드의 방출, 감염9에서점액의 역할, 및 과도한손상(12)에대한 상피 세포 반응에 대한 연구에서 해결되었다. 그러나, CF의 유전돌연변이를 특징으로 하는 신뢰할 수 있는 CF-감염 체외 모델, 공기에 노출되는 (생리학적 상태 증가), 면역 세포를 통합하는 것은 여전히 부족하다.
이 격차를 해소하기 위해 감염된 기도의 안정적인 인간 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 P. aeruginosa에 감염되고 확산 및 면역 학적 장벽을 모두 나타내는 인간 CF 기관지 상피 세포 및 대식세포의 구성이다. 합리적으로 높은 처리량에서 항 감염제를 테스트하는 것을 목표로, 이 공동 배양은 두 개의 인간 세포주를 사용하여 웰 플레이트 인서트의 투과성 필터 멤브레인에 설립되었습니다: CFBE41o– 및 THP-1 단백세포 유래 대식세포. 더욱이, 결국 에어로졸화항감염제(13)의증착을 연구하기 위해, 이 모델은 액체 가루 조건(LCC)이 아닌 공기-액체 인터페이스(ALI)에 확립되었다.
우리가 여기에서 보고하는 바와 같이, 이 모형은 약 발달을 위한 필수적인 매개 변수인 항생 처리에 세균성 생존뿐 아니라 세포 세포 독성, 상피 장벽 무결성, 대식세포 변환 및 선동적인 반응에 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜은 폐기도의 흡입 치료를 위한 두 가지 관련 세포 유형을 결합합니다: 대식세포및 CF 기관지 상피. 이 세포는 투과성 지지 인서트의 반대쪽에 시드되어 공기에 세포 노출을 허용합니다(공기-액체 인터페이스(ALI) 조건이라고 합니다. 숙주 세포의 이러한 공동 배양은 이후에 P. aeruginosa에감염된다. 두 숙주 세포주 모두 인간 기원입니다: 상피 세포는 CF 채널(CFBE41o-)에 돌연변이를 가진 낭포성–섬유증 기관지 상피를 나타내며, THP-114 세포는 잘 특징적인 대식세포와 같은 세포주이다. 동천상피층은 대식세포와 같은 세포가 반대 구획에 추가되기 전에 웰 플레이트 인서츠의 상부에 형성될 수 있게 된다. ALI에서 공동 문화가 확립되면, 시스템은 apical 측에 P. aeruginosa와 접종된다. 이 감염된 공동 배양 시스템은 항생제, 예를 들어 토브라마이신의 효능을 평가하기 위해 사용됩니다. 다음 종점은 분석된다: 상피 방벽 무결성 경피성 전기 저항 (TEER), 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (CLSM)에 의한 세포 세포 및 세포 박테리아 상호 작용의 시각화), 식민지 형성 단위 (CFU), 숙주 세포 생존 (세포 독성) 및 사이토카인 방출의 계산에 의한 세균 생존.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문은 인간 낭포성 섬유증 기관지 상피 세포주 CFBE41o-및 인간 단핵세포세포주 THP-1에 의해 구성된 감염된 기도의 3D 공동 배양을 위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 약물 효능 및 숙주 반응을 동시에 테스트할 때 중요한 매개 변수인 상피 장벽 무결성, 대식세포 변형, 박테리아 생존 및 염증의 평가를 허용합니다. 모델의 참신은 급성 세균 감염(즉, Aeruginosa)을가진 상피 세포(즉, 인…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 유럽 연합의 HORIZON 2020 연구, 기술 개발 및 보조금 협정에 따른 데모 프로그램 642020-MSCA-ITN-2014, NABBA – 생물학적 장벽을 극복하고 심각한 질병을 치료하기 위한 첨단 나노의약품의 설계 및 개발에서 자금을 지원받았습니다. 우리는 아나 코스타 박사와 제니 Juntke 박사에게 공동 문화 개발에 큰 지원을 주셔서 감사합니다, 올가 하트비히, 과학 적인 삽화에 대한, 안자 Honecker, ELISA 분석, 페트라 쾨니히, 야나 웨스트 휴스와 박사 키아라 드 로시 세포 문화, 분석, 현미경 검사법에 대한 지원. 우리는 또한 우리의 원고를 교정 첼시 손 에게 감사드립니다.
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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