Entdeckung von Treiber-Genen in kolorektalen HT29-abgeleiteten Krebs-Stamm-ähnlichen Tumorsphären
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die überexprimierten Treibergene zu entdecken, die die etablierten krebsstammähnlichen Zellen, die aus kolorektalen HT29-Zellen gewonnen wurden, aufrecht erhalten. RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik wurde durchgeführt, um Genexpressionsnetzwerke zu untersuchen und zu untersuchen, um einen potenziellen Mechanismus zu erhellen, der am Überleben von gezielten Tumorzellen beteiligt ist.
Abstract
Krebsstammzellen spielen eine wichtige Rolle gegen klinische Therapien und tragen zum Tumorrückfall bei. Es gibt viele Onkogene, die an der Tumorgenesese und der Initiierung von Krebsstammeigenschaften beteiligt sind. Da die Genexpression bei der Bildung von Darmkrebs-abgeleiteten Tumorsphären unklar ist, braucht es Zeit, um die Mechanismen zu entdecken, die an einem Gen nach dem anderen arbeiten. Diese Studie zeigt eine Methode, um schnell die Treibergene zu entdecken, die am Überleben der darmkrebsstammzellen in vitro beteiligt sind. Kolorektal-HT29-Krebszellen, die den LGR5 exprimieren, wenn sie als Sphäroide kultiviert werden und eine Erhöhung der CD133-Stammtonmarker begleiten, wurden ausgewählt und in dieser Studie verwendet. Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik durchzuführen, um die überexprimierten Treibergene bei der Bildung von kolorektalen HT29-abgeleiteten stammähnlichen Tumorsphären schnell aufzudecken. Die Methodik kann schnell untersuchen und potenzielle Treibergene in anderen Krankheitsmodellen entdecken.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist eine der Haupttodesursachen mit hoher Prävalenz und Sterblichkeit weltweit1,2. Aufgrund von Genmutationen und Amplifikationen wachsen Krebszellen ohne proliferative Kontrolle, was zum Zellüberlebenbeiträgt 3, Anti-Apoptose4und Krebsstamm55,6,7. Innerhalb eines Tumorgewebes ermöglicht die Tumorheterogenität Tumorzellen, sich anzupassen und während der therapeutischen Behandlungen zu überleben8. Krebsstammzellen (CSCs), mit einer höheren Rate an Selbsterneuerung und Pluripotenz als Differentialkrebsarten, sind hauptsächlich für Tumorrezidiv9,10 und metastasierendes CRC11verantwortlich. CSCs präsentieren mehr Arzneimittelresistenz12,13,14 und Anti-Apoptose-Eigenschaften15,16, also überlebende Tumor-Chemotherapien.
Hier wurde RNAseq durchgeführt, um den möglichen Mechanismus für den Stamminstand in den ausgewählten CRC-Stammzellen zu untersuchen, um differenziell exprimierte Gene in Tumorsphäroiden zu untersuchen. Die Krebszellen können Sphäroide (auch Tumorsphären genannt) bilden, wenn sie unter niedrigen Adhärenzbedingungen angebaut und durch Wachstumsfaktoren stimuliert werden, die dem kultivierten Medium hinzugefügt werden, einschließlich EGF, bFGF, HGF und IL6. Daher haben wir CRC HT29 Tumorzellen ausgewählt, die Chemotherapien mit einer Erhöhung der phosphorylierten STAT3 widerstehen, wenn sie mit Oxaliplatin und Irinotecon17behandelt werden. Darüber hinaus drückte HT29 höhere Stammhenmarker aus, wenn sie in den beschriebenen Kulturbedingungen kultiviert wurden. Das HT29-abgeleitete CSC-Modell exprimierte höhere Mengen an leucin-reichem, repeat-haltigem G-Protein-gekoppeltem Rezeptor 5 (LGR5)18, einem spezifischen Marker von CRC-Stammzellen19,20. Darüber hinaus ist CD133, der als allgemeiner Biomarker für Krebsstammzellen gilt, auch in der HT29-Zelllinie21stark exprimiert. Ziel dieses Protokolls ist es, Gruppen von Treibergenen in den etablierten krebsstammähnlichen Tumorsphären zu entdecken, die auf bioinformatischen Datensätzen basieren, im Gegensatz zur Untersuchung einzelner Onkogene22. Es untersucht mögliche molekulare Mechanismen durch RNAseq-Analyse, gefolgt von verfügbaren Bioinformatik-Analysen.
Die Sequenzierung der nächsten Generation ist eine hochdurchsatzbasierte, leicht verfügbare und zuverlässige DNA-Sequenzierungsmethode, die auf rechnerischer Hilfe basiert und zur umfassenden Darstellung von Treibergenen zur Steuerung von Tumortherapien verwendet wird23. Die Technologie wird auch zum Nachweis der Genexpression aus der umgekehrten Transkription einer isolierten RNA-Probe24verwendet. Beim Screening mit RNAseq haben die wichtigsten Gene, die mit der Therapie ins Visier nehmen sollen, jedoch möglicherweise nicht die höchste Expressionsdifferenz zwischen Versuchs- und Kontrollproben. Daher wurden einige Bioinformatik für die Klassifizierung und Identifizierung von Genen auf der Grundlage aktueller Datensätze wie KEGG25, GO26,27oder PANTHER28entwickelt, einschließlich Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 und NetworkAnalyst30. Dieses Protokoll zeigt die Integration von RNAseq und NetworkAnalyst, um schnell eine Gruppe von Genen in den ausgewählten HT29-abgeleiteten Sphäroiden im Vergleich zu elterlichen HT29-Zellen zu entdecken. Die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheitsmodelle wird auch vorgeschlagen, um Unterschiede in wichtigen Genen zu entdecken.
Im Vergleich zur Untersuchung der individuellen Genexpression bietet eine Hochdurchsatztechnik Vorteile, um potenzielle Treibergene für die Tumorpräzisionsmedizin leicht zu finden. Mit nützlichen Datensätzen wie KEGG, GO oder PANTHER können spezifische Gene anhand der Krankheitsmodelle, Signalwege oder spezifischer Funktionen identifiziert werden, was eine schnelle Fokussierung auf bestimmte, wichtige Gene ermöglicht, wodurch Zeit und Forschungskosten gespart werden. Eine ähnliche Anwendung wird in früheren Studienverwendet 14,18,31. Insbesondere ist ein Tumor komplizierter, weil verschiedene Arten von Tumoren unterscheidende Gene und Wege für Überleben und Proliferation ausdrücken. Daher kann dieses Protokoll Gene aufnehmen, die verschiedene Tumortypen unter verschiedenen Umständen unterscheiden. Es besteht das Potenzial, wirksame Strategien gegen Krebs zu finden, indem man den Mechanismus der spezifischen Genexpression versteht.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurden kultivierte Krebsstamm-ähnliche Tumorsphären als Modell zur Analyse von RNAseq-Daten mit verfügbarer Bioinformatik verwendet. Für ein Krankheitsmodell wurden HT29-abgeleitete Tumorsphären verwendet. Da die Tumorsphären eine Arzneimittelresistenz gegen Tumortherapien haben, kann das etablierte Modell verwendet werden, um die detaillierten Mechanismen der Resistenz zu untersuchen, indem Unterschiede in der Genexpression untersucht werden. Darüber hinaus bietet die Genomtechnologie mit RNAseq …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Radiation Biology Core Laboratory des Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde durch Stipendien des Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), des Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) und des Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 und MMH-106-61) unterstützt. Die Förderstellen hatten keinen Einfluss auf die Gestaltung der Studie und die Datenerhebung, Analyse und Interpretation von Daten oder auf das Schreiben des Manuskripts.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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