Oppdagelsen av drivergener i kolorektal HT29-avledede kreftstammelignende tumorsfærer
Summary
Presentert her er en protokoll for å oppdage de overuttrykte drivergenene som opprettholder de etablerte kreftstamlignende cellene avledet fra kolorektal HT29-celler. RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk ble utført for å undersøke og screene genuttrykksnettverk for å belyse en potensiell mekanisme involvert i overlevelsen av målrettede tumorceller.
Abstract
Kreft stamceller spiller en viktig rolle mot kliniske terapier, bidrar til tumor tilbakefall. Det er mange onkogener involvert i tumorigenesis og initiering av kreft stemness egenskaper. Siden genuttrykk i dannelsen av kolorektal kreftavledede tumorsfærer er uklart, tar det tid å oppdage mekanismene som arbeider på ett gen om gangen. Denne studien viser en metode for raskt å oppdage drivergenene som er involvert i overlevelsen av de kolorektalkreft stamceller in vitro. Kolorektal HT29 kreftceller som uttrykker LGR5 når dyrket som sfæroider og følge en økning CD133 stemness markører ble valgt og brukt i denne studien. Protokollen som presenteres brukes til å utføre RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk for raskt å avdekke de overuttrykte drivergenene i dannelsen av kolorektal HT29-avledede stammelignende tumorsfærer. Metodikken kan raskt screene og oppdage potensielle drivergener i andre sykdomsmodeller.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er en ledende dødsårsak med høy prevalens og dødelighet over hele verden1,,2. På grunn av genmutasjoner og forsterkninger vokser kreftceller uten proliferativ kontroll, noe som bidrar til celleoverlevelse3,anti-apoptose4og kreftstamme5,6,7. Innenfor et tumorvev tillater tumor heterogenitet tumorceller å tilpasse seg og overleve under terapeutiske behandlinger8. Kreftstamceller (CSCer), med en høyere grad av selvfornyelse og pluripotency enn differensialkrefttyper, er hovedsakelig ansvarlig for tumortilfall9,,10 og metastatisk CRC11. CsCs presentere mer narkotikaresistens12,13,14 og anti-apoptose egenskaper15,16, dermed overlevende tumor kjemoterapi.
Her, for å undersøke den potensielle mekanismen for stemness i de valgte CRC stamceller, RNAseq ble utført for å screene differensial uttrykte gener i tumor sfæroider. Kreftcellene kan danne sfæroider (også kalt tumorsfærer) når dyrket i lave tilslutning forhold og stimulert av vekstfaktorer lagt til kultivert medium, inkludert EGF, bFGF, HGF, og IL6. Derfor valgte vi CRC HT29 tumorceller som motstår kjemoterapi med en økning i fosforoid STAT3 når de behandles med oksaliplatin og irinotekon17. I tillegg uttrykte HT29 høyere stenktetthetsmarkører når de dyrkes i de beskrevne kulturforholdene. Den HT29-avledede CSC-modellen uttrykte høyere mengder leucinrike repeterende G-protein-koblet reseptor 5 (LGR5)18, en bestemt markør for CRC stamceller19,,20. Videre er CD133, ansett som en generell biomarkør for kreft stamceller, også sterkt uttrykt i HT29 cellelinje21. Denne protokollen sin hensikt er å oppdage grupper av drivergener i de etablerte kreftstammelignende tumorsfærene basert på bioinformatikk datasett i motsetning til å undersøke individuelle onkogener22. Den undersøker potensielle molekylære mekanismer gjennom RNAseq-analyse etterfulgt av tilgjengelige bioinformatikkanalyser.
Neste generasjons sekvensering er en høygjennomstrømning, lett tilgjengelig og pålitelig DNA-sekvenseringsmetode basert på beregningshjelp, som brukes til å omfattende skjermdrivergener for å veilede tumorterapi23. Teknologien brukes også til å oppdage genuttrykk fra omvendt transkripsjon av en isolert RNA-prøve24. Men når du screener med RNAseq, kan det hende at de viktigste genene som er målrettet mot terapi, ikke har den høyeste uttrykksforskjellen mellom eksperimentelle og kontrollprøver. Derfor ble noen bioinformatikk utviklet for å klassifisere og identifisere gener basert på nåværende datasett som KEGG25,GO26,,27eller PANTHER28,inkludert Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 og NetworkAnalyst30. Denne protokollen viser integreringen av RNAseq og NetworkAnalyst for raskt å oppdage en gruppe gener i de valgte HT29-avledede sfæroidene sammenlignet med foreldrenes HT29-celler. Anvendelse av denne metoden til andre sykdomsmodeller er også foreslått for å oppdage forskjeller i viktige gener.
Sammenlignet med undersøkelse av individuelle genuttrykk, gir en høy gjennomstrømningsteknikk fordeler med å finne potensielle drivergener lett for tumorpresisjonsmedisin. Med nyttige datasett som KEGG, GO eller PANTHER kan spesifikke gener identifiseres basert på sykdomsmodellene, signalveiene eller spesifikke funksjoner, og dette gjør det mulig å fokusere raskt på spesifikke, viktige gener, noe som sparer tid og forskningskostnader. En lignende applikasjon brukes i tidligere studier14,18,31. Spesielt er en svulst mer komplisert fordi ulike typer svulster uttrykker skille gener og veier for overlevelse og spredning. Derfor kan denne protokollen plukke opp gener som skiller forskjellige tumortyper under forskjellige omstendigheter. Det er potensial til å finne effektive strategier mot kreft ved å forstå mekanismen for spesifikt genuttrykk.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble kultiverte kreftstammelignende tumorsfærer brukt som modell for å analysere RNAseq-data med tilgjengelig bioinformatikk. For en sykdomsmodell ble HT29-avledede tumorsfærer brukt. Fordi tumorsfærene har legemiddelresistens mot tumorterapi, kan den etablerte modellen brukes til å undersøke de detaljerte resistensmekanismene ved å undersøke forskjeller i genuttrykk. Videre gir genomteknologi ved hjelp av RNAseq med tilgjengelig bioinformatikk rask forståelse av studiemodellen slik at genene som …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, for teknisk støtte. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), og Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 og MMH-106-61). Finansieringsorganer hadde ingen innflytelse i utformingen av studien og datainnsamling, analyse og tolkning av data eller skriftlig manuskriptet.
Materials
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
Riferimenti
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia. Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).
- Liu, Q., et al. Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved. Cell Death & Disease. 10 (7), 509 (2019).
- Slattery, M. L., et al. Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients. Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).
- Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).
- Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).
- Cheng, C. C., et al. YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells. PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).
- Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective. Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).
- Zhao, Y., et al. CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).
- Choi, J. E., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance. Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).
- Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation. Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).
- Dallas, N. A., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Ricerca sul cancro. 69 (5), 1951-1957 (2009).
- Chang, Y. F., et al. STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers. BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).
- Catalano, V., et al. Colorectal cancer stem cells and cell death. Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).
- Piggott, L., et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL. Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).
- Chung, S. Y., et al. Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells. Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).
- Cheng, C. C., et al. STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).
- Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).
- Medema, J. P. Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell. New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).
- Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).
- Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data. Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).
- Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment. Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).
- Kanehisa, M., Sato, Y. KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences. Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), (2000).
- The Gene Ontology Collective. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).
- Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).
- Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).
- Zhou, G., et al. NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis. Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).
- Cheng, C. C., et al. Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers. Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
