Summary
La méthode décrite ci-dessous vise à fournir un protocole complet pour la préparation de la neurochirurgie non humaine des primates (PSN) à l’aide d’une nouvelle combinaison de méthodes d’impression tridimensionnelles (3D) et d’extraction de données IRM.
Abstract
Dans cet article, nous décrivons une méthode de préparation chirurgicale qui permet la planification pratique d’une variété de neurochirurgies dans les PSN uniquement à l’aide de données extraites de la formation image par résonance magnétique (IRM). Ce protocole permet la génération de modèles physiques anatomiquement précis imprimés en 3D du cerveau et du crâne, ainsi qu’un modèle de gel agarose du cerveau modelant certaines des propriétés mécaniques du cerveau. Ces modèles peuvent être extraits de l’IRM à l’aide d’un logiciel d’extraction du cerveau pour le modèle du cerveau, et de code personnalisé pour le modèle du crâne. Le protocole de préparation tire parti de la technologie d’impression 3D de pointe pour fabriquer des cerveaux, des crânes et des moules interfacants pour les modèles de cerveaux en gel. Les modèles du crâne et du cerveau peuvent être utilisés pour visualiser les tissus cérébraux à l’intérieur du crâne avec l’ajout d’une craniotomie dans le code personnalisé, permettant une meilleure préparation pour les chirurgies impliquant directement le cerveau. Les applications de ces méthodes sont conçues pour les chirurgies impliquées dans la stimulation neurologique et l’enregistrement ainsi que l’injection, mais la polyvalence du système permet l’expansion future du protocole, des techniques d’extraction et des modèles à un plus large éventail de chirurgies.
Introduction
La recherche sur les primates a été une étape cruciale dans la progression de la recherche médicale des modèles animaux aux essaishumains 1,2. C’est particulièrement le cas dans l’étude des neurosciences et de l’ingénierie neuronale, car il existe un écart physiologique et anatomique important entre le cerveau des rongeurs et celui des primates non humains (PSN)1,2,3. Avec les technologies génétiques émergentes telles que la chimiogénétique, l’optogénétique et l’imagerie calcique qui nécessitent une modification génétique des neurones, la recherche en génie neuronal étudiant la fonction neuronale dans les PSN a attiré une attention particulière en tant que modèle préclinique pour comprendre la fonctioncérébrale 2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Dans la plupart des expériences en neurosciences du PSN, des mesures neurochirurgicales sont nécessaires pour l’implantation de divers dispositifs tels que les poteaux de tête, les chambres de stimulation et d’enregistrement, les tableauxd’électrodes etles fenêtres optiques 4,5,6,7,10,11,13,14,15,17,18.
Les laboratoires actuels de PSN utilisent une variété de méthodes qui comprennent souvent des pratiques inefficaces, y compris la sedating de l’animal pour s’adapter aux jambes d’un poteau de tête et se rapprocher de la courbure du crâne autour du site de craniotomie. D’autres laboratoires s’adaptent le poteau de tête au crâne dans la chirurgie ou emploient des méthodes plus avancées d’obtenir les mesures nécessaires pour l’implantation comme l’analyse d’un atlas de cerveau de NHP et des balayages de résonance magnétique (MR) pour essayer d’estimer des courbures decrâne 2,10,11,16. Les neurochirurgies dans les PSN impliquent également des injections de liquide, et les laboratoires n’ont souvent aucun moyen de visualiser l’emplacement d’injection projeté dansle cerveau 2,4,5,13,14 en se fondant uniquement sur des mesures stéréotaxiques et la comparaison avec les balayages de MR. Ces méthodes ont un degré d’incertitude inévitable de ne pas être en mesure de tester la compatibilité physique de tous les composants complexes de l’implant.
Par conséquent, il est nécessaire d’avoir une méthode non invasive précise pour la planification neurochirurgical dans les PSN. Ici, nous présentons un protocole et une méthodologie pour la préparation des chirurgies d’implantation et d’injection chez ces animaux. L’ensemble du processus provient de l’IRM, où le cerveau et le crâne sont extraits des données pour créer des modèles tridimensionnels (3D) qui peuvent ensuite être imprimés en 3D. Les modèles du crâne et du cerveau peuvent être combinés pour se préparer aux chirurgies de craniotomie ainsi qu’aux poteaux de tête avec un niveau accru de précision. Le modèle cérébral peut également être utilisé pour créer un moule pour la coulée d’un modèle de gel anatomiquement précis du cerveau. Le cerveau gel seul et en combinaison avec un crâne extrait peut être utilisé pour se préparer à une variété de chirurgies d’injection. Ci-dessous nous allons décrire chacune des étapes requises pour la boîte à outils basée sur l’IRM pour la préparation neurochirurgical.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Washington. Deux macaques rhésus mâles (singe H : 14,9 kg et 7 ans, singe L : 14,8 kg et 6 ans) ont été utilisés.
1. Acquisition d’images
- Transportez le singe à un scanner IRM 3T et placez l’animal dans un cadre stéréotaxique compatible MR (Table of Materials).
- Enregistrez le T1 standard (angle flip = 8°, temps de répétition/temps d’écho = 7,5/3,69 s, taille matricielle = 432 x 432 x 80, durée d’acquisition = 103,7 s, Multicoil (Tableau des matériaux), nombre de moyennes = 1, épaisseur de tranche = 1 mm) images MR anatomiques.
REMARQUE : Pour réussir l’isolement du crâne, utilisez les paramètres d’acquisition de l’IRM appliqués ici pour maximiser la séparation entre le crâne et le cerveau.
2. Extraction du cerveau
- Dans le logiciel d’imagerie MR pour l’extraction du cerveau, sélectionnez Open | Image ouverte. Chargez l’analyse T1 Quick Magnetization Prepared Rapid Gradient Echo (MPRAGE) acquise à l’étape 1.2 dans un logiciel d’imagerie MR(Tableau des matériaux).
- Pour extraire le cerveau, sous le menu plugins dropdown sélectionnez Extract Brain (BET). Extraire à un seuil d’intensité autour de 0,5− 0,7 et définir la valeur de gradient seuil à 0. Utilisez à plusieurs reprises la fonction d’extraction à des seuils d’intensité successivement inférieurs jusqu’à ce que l’analyse ne contienne que l’anatomie corticale (figure 1B).
REMARQUE: Il s’agit d’un processus itératif parce que le logiciel n’est pas conçu pour les cerveaux NHP et l’extraction n’est pas précise - Dans le menu de la région d’intérêt (ROI), sélectionnez Seuil de retour sur investissement et sélectionnez l’option shrink wrap et 3D afin de créer une bitmap du cerveau. Cela convertira le volume en bits binaires à partir d’un gradient, ce qui rationalise les futurs processus de génération de modèles. Choisissez un seuil (généralement autour de 600) pour isoler le cerveau des tissus environnants. Ce seuil peut être trouvé en planant au-dessus de la matière grise. Sélectionnez OK pour former le bitmap.
- Pour créer une surface, sélectionnez Build Surface sous le menu image et entrez le seuil utilisé pour extraire le cerveau à l’étape 2.3. Ensuite, sélectionnez OK. La surface résultante peut être utilisée comme référence pour ajuster la valeur seuil afin de produire la représentation de la plus haute qualité de l’anatomie ciblée (figure 1C).
- Sous l’onglet fichier sélectionnez Enregistrer ou enregistrer comme, et enregistrer le roi du cerveau extrait comme un fichier .nii ou .nii.gz pour une utilisation dans la création du modèle du cerveau.
3. Modélisation du cerveau
- Sélectionnez les données de charge | Choisissez des fichiers pour ajouter et charger le cerveau extrait enregistré dans le type de fichier .nii ou .nii.gz dans le logiciel médical de traitement d’image ( Tableau desmatériaux).
- Planez au-dessus de l’accueil à slicer déposer menu dans la barre d’outils modules et passer à tous les modules. Dans ce menu, sélectionnez la fonctionnalité Editor. Cliquez OK sur l’avertissement popup.
- À partir du menu du module Editor, sélectionnez Threshold Effect et ajustez les curseurs de plage de seuil de sorte que la partie de la bitmap contenant le cerveau est mise en évidence dans les trois tranches. Lors du chargement d’une bitmap, l’ajustement des deux curseurs à une valeur de 1 sélectionne l’ensemble du cerveau. Sélectionnez Appliquer.
- Ouvrez le module de fabricant de modèles, et dans le menu dropdown volumes d’entrée sélectionnez le fichier bitmap généré à l’étape 3.3. Sous Modèles, sélectionnez Créer une nouvelle hiérarchie de modèles. Après avoir attribué le nom du modèle à la hiérarchie, sélectionnez Appliquer pour créer le volume.
- Enregistrez le fichier dans le format .stl.
- Pour modifier davantage le modèle cérébral, chargez le fichier .stl comme un corps graphique dans un logiciel de conception assistée par ordinateur (Table of Materials)
REMARQUE : Cela peut prendre un certain temps, car les surfaces cérébrales en maille importées sont souvent assez complexes. - Une fois le fichier importé, dans l’arbre de fonctionnalités sur le côté gauche de l’écran cliquez sur les enfants du corps graphique et supprimer les fonctionnalités graphiques inutiles jusqu’à ce que seules les fonctionnalités contenant le cerveau restent dans le fichier. Enregistrez le fichier restant comme un .prt pour d’autres manipulations et comme un .stl pour l’impression 3D. Enregistrez le fichier restant comme un .prt pour d’autres manipulations et comme un .stl pour l’impression 3D.
4. Moulage du cerveau
- Chargez le modèle de cerveau extrait de la section 3 au logiciel de conception assisté par ordinateur en ouvrant le fichier .prt. Sous la section caractéristiques du menu insert, sélectionnez Convertir en corps en maille. Sélectionnez le corps graphique du cerveau et convertissez-le.
- Création d’un moule droit et gauche du cerveau complet
- Cliquez sur le bouton Croquis et sélectionnez le plan supérieur comme plan de croquis. Dessinez un rectangle contenant l’ensemble de l’hémisphère droit ou gauche du cerveau. Sélectionnez la fonction boss/base extrude dans l’esquisse et extrudez un rectangle cubique pour contenir la partie supérieure du cerveau.
REMARQUE : Le cube peut devoir être extrudé dans deux directions afin de contenir tout l’hémisphère. C’est parce que le point zéro, où le plan d’extrusion est situé, peut tomber à l’intérieur du modèle cérébral. L’extruding dans les deux directions assure que le moule englobera tout le volume d’intérêt. - Sous la section caractéristiques du menu « insérer », sélectionnez Convertir en corps en maille. Sélectionnez le cube extrudé dans le dossier Corps solides et convertissez-le. Pour créer l’espace négatif, soustrayez le modèle du cerveau du cube nouvellement extrudé en utilisant la fonction Combine et en sélectionnant l’option de soustracte.
- Répétez les étapes 4.2.1 et 4.2.2 pour l’autre hémisphère du cerveau (gauche ou droite) et enregistrez les fichiers résultants comme un .stl pour l’impression 3D et un .prt pour d’autres manipulations.
- Cliquez sur le bouton Croquis et sélectionnez le plan supérieur comme plan de croquis. Dessinez un rectangle contenant l’ensemble de l’hémisphère droit ou gauche du cerveau. Sélectionnez la fonction boss/base extrude dans l’esquisse et extrudez un rectangle cubique pour contenir la partie supérieure du cerveau.
- Création d’un moule droit et gauche de la moitié supérieure du cerveau.
- Créez un croquis dans le plan supérieur et dessinez un rectangle contenant l’ensemble de l’hémisphère droit ou gauche du cerveau. Sélectionnez la fonction boss/base extrude dans le croquis et extrudez avec la fonction Offset de Plane sélectionnée. Compensez l’extrusion jusqu’à une distance où il n’y a pas de contours en surplomb dans l’anatomie du cerveau, capturant seulement l’anatomie supérieure. Sous la section caractéristiques du menu « insérer », sélectionnez Convertir en corps en maille. Sélectionnez le cube extrudé dans le dossier Corps solides et convertissez-le.
- Pour créer l’espace négatif, soustrayez le modèle du cerveau du cube nouvellement extrudé en utilisant la fonction Combine et en sélectionnant l’option de soustracte.
- Créez un plan d’esquisse sur le côté dorsal du moule et sélectionnez Convertir les entités, puis sélectionnez l’esquisse à partir de l’étape 4.3.1.
- Sélectionnez la fonction boss/base d’extrude pendant que dans l’esquisse et, avec l’option d’extrude aveugle sélectionnée, extruder le corps solide d’environ 5 mm pour enfermer complètement l’anatomie soustraite du cerveau dans le moule.
- Répétez les étapes 4.3.1−4.3.4 pour l’autre hémisphère du cerveau (gauche ou droite) et enregistrez les fichiers résultants comme un .stl pour l’impression 3D et un .prt pour d’autres manipulations.
- En changeant les dimensions et l’emplacement du cube et en suivant le même protocole (étapes 4.1 et 4.2), créez des moules qui contiennent différentes parties du cerveau.
- Pour l’impression 3D, utilisez une densité de remplissage d’environ 70 % et augmentez l’épaisseur de la coque extérieure de l’impression afin de minimiser les fuites du matériau de moulage. S’il y a des lacunes ou des défauts dans l’impression, remplissez-les à l’aide d’un vernis à ongles ou d’un autre agent liant.
5. Modélisation de crâne
- Importez l’IRM QUICK MPRAGE de l’étape 1.2 dans le logiciel de manipulation matricielle en tant que fichier DICOM. Le fichier DICOM peut être dans des cadres 2D distincts. Si c’est le cas, combinez tous les cadres dans une matrice 3D. Assurez-vous que chaque cadre 2D de la matrice affiche une tranche coronale.
- Créez un masque binaire en seuil de la matrice 3D à l’aide d’un opérateur supérieur aux valeurs des pixels individuels. Ajustez le seuil de telle sorte que l’anatomie du crâne est capturée par le masque (voir fichier de codage supplémentaire CalibrateMask).
REMARQUE : Le masque contiendra quatre couches distinctes. De l’extérieur, ils seront appelés « extérieur », « musculature », « crâne », et « cerveau ». À ce stade, « à l’extérieur » et « crâne » sont de 0 dans le masque, et « musculature » et « cerveau » sont 1. - Pour enlever la couche de « musculature », traiter chaque image du masque 3D séparément en saisissant itérativement une tranche 2D du masque (c.-à-d. 3D_Mask (:,:,1)).
- Pour chaque image, sélectionnez 0 pixels dans les coins du cadre dans la couche « extérieure » comme « graine ». Ensuite, recherchez les 0 voisins jusqu’à ce que vous rencontrez un pixel 1. Continuez à chercher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de 0. Convertissez tous les 0 connectés en 1. Ceci est fait en utilisant la fonction Matlab « imfill », avec les entrées et les sorties étant [MASK2] = imfill (MASK1,LOCATIONS,CONNECTIVITY), où MASK1 est votre masque d’origine, et MASK2 est le masque rempli (voir fichier de codage supplémentaire FillExterior).
- Certaines informations sur le crâne seront perdues lors de l’enlèvement. Pour atténuer la perte d’information, effectuez l’étape 5.3 dans les trois dimensions des données et gardez-les séparées.
REMARQUE : Maintenant, les deux « extérieurs » et « musculature » sont 1, et seront considérés comme « extérieurs ». Le masque contient maintenant trois couches distinctes, « extérieur », « crâne » et « cerveau ». « Dehors » et « cerveau » sont 1, et « crâne » est de 0. - Inverser les valeurs du masque à l’aide de l’opérateur ~ (c.-à-MASK2 = ~MASK1). Maintenant, « crâne » est de 1 et « à l’extérieur » et « cerveau » sont de 0.
- Les 1 qui se touchent dans chaque masque peuvent être considérés comme des « objets ». Créez un index de tous les objets de chaque masque à l’aide de la fonction Matlab « bwconncomp », les entrées et sorties étant [CC] = bwconncomp(MASK), où MASK est la matrice du masque 3D, et CC est un objet structurel contenant les valeurs d’index de chaque objet, le nombre d’objets et la taille de la matrice. Pour chaque masque, retirez tous les objets sauf le plus grand contenant le plus de voxels en fixant les valeurs des petits objets à 0 (voir fichier de codage supplémentaire RemoveNoise).
- Ajoutez les masques créés à partir de chaque passage ensemble (voir fichier de codage supplémentaire MergeMasks).
- Échelle du cerveau à une résolution cohérente.
- De l’en-tête DICOM, comparez la taille de l’étape entre chaque image de l’IRM aux dimensions de chaque pixel.
- Si ces valeurs sont différentes, définissez un facteur d’échelle pour compenser la différence de résolution entre la taille de l’étape et la taille des pixels pour chaque voxel. Par exemple, si chaque image est séparée de 1 mm et que la dimension pixel est de 0,33 mm x 0,33 mm, le facteur d’échelle sera de 3.
- Ajoutez des voxels vides supplémentaires au masque 3D jusqu’à ce que la dimension de résolution la plus basse du masque soit plus grande par un facteur défini par le facteur d’échelle (voir fichier de codage supplémentaire « ScaleMask»).
- Interpoler linéairement les valeurs du masque jusqu’à ce que le masque remplisse le nouvel espace.
- Exportez le crâne comme un fichier .stl ou un type de fichier similaire pour l’impression 3D.
6. Création de craniotomie dans le modèle de crâne 3D
- À l’aide du fichier IRM de l’étape 5.1, identifier manuellement l’emplacement approximatif de la craniotomie à partir de repères anatomiques trouvés dans l’atlas du cerveau des macaques (p. ex., sulcus central)19.
- Voir une tranche individuelle de la matrice 3D (similaire à l’étape 5.3).
- Numérisez manuellement vers l’avant ou vers l’arrière à travers la matrice 3D jusqu’à ce que des repères anatomiques reconnaissables soient localisés.
- Enregistrer le numéro d’image sous forme de coordonnée z (c.-à-d. 3D_Mask (:,:,z)
- Utilisez un outil de sélection de données pour enregistrer les coordonnées x et y d’un seul point sur ce cadre pour que la craniotomie soit centrée sur l’utilisation de la fonction Matlab « getpts », avec les entrées et les sorties étant [x,y] = getpts. « getpts » ouvre une interface utilisateur, cliquez sur le cadre désiré (voir fichier de codage supplémentaire LocateCraniotomy).
- Convertissez le rayon de la craniotomie prévue de mm en voxels à l’aide des informations contenues dans l’en-tête DICOM.
- En utilisant le point spécifié à l’étape 6.1 comme point central, définissez tous les voxels dans le rayon défini en 6,2 à zéro dans le masque de l’étape 5.8.4 en utilisant le fichier de codage supplémentaire Craniotomy, où les entrées et les sorties sont [craniotomyMask] = Craniotomy (masque, x, y, z, rayon, X, Y, Z, résolution) où cranitomyMask est une matrice 3D avec une craniotomie enlevée, le masque est la matrice 3D initiale, x,y,z sont les coordonnées de point central de la craniotomie, le rayon est le rayon de la craniotomie, X,Y,Z sont des vecteurs de grille de la matrice 3D, et la résolution est votre rayon défini à l’étape 6.2 (voir fichier de codage supplémentaire Craniotomy).
- Pour plusieurs craniotomies, répétez les étapes 6.1−6.3 pour chaque craniotomie unique.
- Exportez le crâne comme un fichier .stl ou un type de fichier similaire pour l’impression 3D.
Impression 7.3D 7
REMARQUE : Deux types d’imprimantes 3D pour les prototypes physiques(Tableau des matériaux)sont utilisés. Pour les spécifications suivantes, tous les paramètres de l’imprimante 3D et des logiciels d’impression doivent être par défaut, sauf indication contraire.
- Afin d’imprimer les prototypes et les moules, utilisez une imprimante PLA standard(Table of Materials)et créez le G-Code avec les paramètres suivants de l’imprimante et du logiciel : densité intérieure >50% (ceci est particulièrement important pour les moules car ils doivent contenir du liquide), modèle de remplissage interne en nid d’abeille rapide, motif de remplissage externe rectilinaire, température de la plaque = 50 °C, température de l’extruder = 230 °C.
- Afin d’imprimer des modèles de fidélité plus élevée du cerveau et du crâne utiliser une imprimante de qualité industrielle pour faire une impression combinée de styrène acrylonitrile butadiène (ABS) pour le modèle et un matériau de soutien insoluble (Tableau des matériaux). Créez ensuite le Code G et avec les paramètres d’imprimante suivants : remplissez le style Sparse - High Density. Tous les autres paramètres seront automatiquement définis sur le paramètre par défaut approprié.
- Dissoudre le modèle dans le solvant desoutien ( Tableau desmatériaux ) pour ~ 12 h.
- Après avoir implémenté les paramètres d’imprimante appropriés, appuyez sur Démarrer et regarder la première couche de l’impression pour vous assurer que la couche de base est propre et uniforme.
- Après l’impression 3D des moules, patcher tous les trous visibles avec du vernis à ongles (Table of Materials) pour garantir un joint plus serré.
REMARQUE : Les modèles cérébraux et crânes imprimés en 3D peuvent être combinés en insérant le modèle cérébral dans le bas ouvert du crâne. Enlever l’anatomie oculaire peut faciliter le placement du modèle cérébral sans perdre d’informations importantes. Lorsqu’il est placé à l’intérieur du crâne, le cerveau s’aligne naturellement à la position anatomiquement correcte.
8. Préparation de l’agarose
- Mélanger la poudre d’agar (Table of Materials) et la poudre de gomme de haricots acridiens ( Table ofMaterials) dans un rapport de 1:4 par masse.
- Combinez le mélange de poudre avec 1x solution tamponnée de phosphate (Tableau des matériaux) à une solution de concentration de 0,6% dans un flacon Erlenmeyer.
REMARQUE : Les concentrations utilisées par d’autres laboratoires se situent entre 0,5 % et 0,6% 20,21. - Réglez le four à micro-ondes à puissance maximale et placez le flacon contenant la solution au micro-ondes pendant 2 min.
- Observez la solution. Lorsque la solution commence à bouillonner, arrêtez le micro-ondes et la incontriseur, retirez le flacon et tourbillonnez vigoureusement. Remettre le flacon au micro-ondes et reprendre le four à micro-ondes et la mise à l’heure.
REMARQUE: Le but est de chauffer la solution sans réduire le volume de manière significative en raison de l’évaporation pendant l’ébullition. - Répétez l’étape 8.4 jusqu’à ce que les deux minutes soient terminées.
- Retirez le flacon et maintenez le tourbillon pour empêcher la solution de se mettre dans le flacon.
- Faire fonctionner l’eau froide à l’extérieur du flacon pour refroidir la solution tout en tourbillonnant. Refroidir la solution jusqu’à ce que l’extérieur du flacon soit chaud au toucher, mais tolérable et sûr, pour empêcher la solution de déformer le moule en plastique dans les étapes suivantes.
- Faites tourbillonner le flacon tout en transportant la solution au moule pour éviter le durcissement prématuré.
9. Moulage agarose
NOTE : Le processus de moulage d’agarose décrit ci-dessous est le même pour l’hémisphère complet et les moules supérieurs de demi-hémisphère
- Verser la solution agarose dans l’un des moules du cerveau jusqu’à ce qu’il soit plein. Continuer à tourbillonner la solution restante dans le flacon.
- Surveillez le niveau de solution dans le moule pour les fuites. Remplissez le moule au besoin puisque l’agarose de réglage scellera toutes les fuites dans le moule.
- Laissez la solution dans le moule s’asseoir imperturbable à température ambiante jusqu’à ce que la solution se soit réglée et durcie en un solide.
REMARQUE : Bien que les temps d’attente puissent varier en fonction du volume de solution et d’autres facteurs, 2 h s’est révélé être un temps d’attente fiable. - À l’aide d’une spatule, retirer délicatement le modèle de gel du moule. Soyez stratégique avec l’emplacement de l’insertion de spatule dans le moule afin d’empêcher des déformations potentielles à la surface du moule.
- Pour ralentir le processus naturel d’évaporation et l’exposition aux agents biologiques, placez le modèle de gel dans un contenant scellé dans un réfrigérateur.
10. Injection dans le modèle de gel d’agarose
- Préparez la pompe pour infusion et fixez-la dans un bras stéréotaxique sur un cadre stéréotaxique (Table of Materials). Placez la pompe à la trajectoire d’injection correcte et l’emplacement normal à la surface du modèle de gel de la section 9.
- Remplissez une seringue de 250 μL(tableau des matériaux) avec del’eau DI. Monter la seringue sur la pompe (Table des matériaux).
REMARQUE : Avant de dessiner n’importe quel colorant, l’eau di devrait remplir complètement la canuled’injection (tableaudes matériaux). De cette façon, lorsque le colorant est établi à travers la canule, il n’y a pas de compression ou d’expansion de l’air par le piston qui pourrait avoir un impact sur le volume d’injection. - Utilisez le conducteur de la pompe (Table of Materials) pour retirer la coloration des aliments ( Tableau desmatériaux) dans la seringue au volume cible pour l’injection. Injecter la coloration des aliments lentement jusqu’à ce qu’une petite perle se forme à la pointe de la canule pour empêcher les bulles d’air d’être injectées dans le gel. Sécher la perle de la pointe de la canule.
- Placez le modèle de gel sous la canule. Abaissez la canule jusqu’à ce que la pointe touche la surface du modèle de gel. Notez les mesures sur le bras stéréotaxique.
- Abaissez la canule dans le modèle de gel rapidement et en douceur à la profondeur d’injection cible et assurez-vous que la surface du gel s’est scellée autour de la canule.
- Exécutez la pompe et observez la propagation de la coloration des aliments jusqu’à ce que le volume cible soit injecté. Commencez par un débit de 1 μL/min et augmentez à 5 μL/min avec 1 μL/min à chaque minute. La propagation de la coloration alimentaire dans le gel est une approximation de la propagation d’un vecteur viral dans le cerveau.
- Retirer la canule du gel rapidement et en douceur.
- Capturez des images de la propagation de la coloration alimentaire à l’aide d’un dispositif photographique(Tableau des matériaux)et mesurez physiquement les dimensions de l’embolie afin de calculer le volume ellipsoid de l’injection. Cette approche est possible en raison de la nature transparente du gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La manipulation et l’analyse des IRM en tant que mesure préopératoire de planification de la craniotomie ont été utilisées avec succès au coursdes 2,5,10,16 dernièresannées. Ce processus, cependant, a été considérablement amélioré par l’ajout de la modélisation 3D du cerveau, du crâne, et de la craniotomie. Nous avons réussi à créer un modèle physique anatomiquement précis du cerveau qui reflétait la zone d’intérêt pour nos études (Figure 1). Nous avons également pu créer un modèle physique anatomiquement précis du crâne des primates extrait des images MR (Figure 2).
Les deux modèles physiques du crâne et du cerveau combinés à un ajustement serré d’interférence, validant l’exactitude des deux modèles par rapport à l’autre et légitimant les données extrapolées d’analyse d’IRM (figure 3A,B). Avec le modèle combiné, nous avons pu insérer une craniotomie dans le crâne avant d’imprimer et de visualiser l’anatomie prédite dans la craniotomie (Figure 3). L’exactitude de l’anatomie prévue dans la craniotomie a été validée par une comparaison du modèle physique et de la craniotomie prévue de l’analyse d’IRM (figure 3B). De plus, nous avons pu combiner toutes les parties de notre interface d’exemple et évaluer la géométrie des différents composants par rapport au crâne et au cerveau (figure 3C,D).
Afin de tester le modèle de crâne, un modèle physique du crâne de Monkey L a été extrait en utilisant les méthodes décrites ci-dessus et imprimées en 3D pour planifier une chirurgie post-implantation de la tête. Les pieds du poteau de tête ont ensuite été manipulés et montés à la courbure du crâne à l’emplacement de l’implantation (Figure 3E). En raison de l’ajustement préopératoire du poteau de tête, le temps de chirurgie a été réduit d’approximativement 2.5 heures à 1 heure (216% plus rapide) de l’ouverture à l’implantation, réduisant considérablement le risque des complicationsopératoires 22.
En manipulant le modèle 3D du cerveau dans SolidWorks, nous avons pu créer un moule qui reflétait avec précision l’anatomie du cerveau imprimé et du modèle cérébral extrait de l’IRM (figure 4A−C). Ce moule a été utilisé pour jeter un modèle de mélange d’agarose du cerveau( Figure 4D,E). En utilisant ces moules du cerveau, nous avons pu injecter dans différentes zones du cerveau et estimer le volume de l’infusion d’une procédure d’injection modélisée avec un colorant jaune (Tableau des matériaux). Le modèle de gel demi-hémisphère du cerveau a été utilisé avec succès pour capturer une vue claire de la propagation du colorant dans une injection de virus modèle, ce qui nous permet de mesurer un volume approximatif de la teinture au fil du temps comme il a été injecté (Figure 5A). L’injection de colorant dans le modèle cérébral a été combinée avec un crâne imprimé en 3D pour modéliser la chirurgie d’injection vectorielle virale (figure 5B,C). Ceci a été combiné avec un placement de tableau d’électrocorticographie au-dessus de l’injection pour guider l’implantation en préparationpour la chirurgie 7,10.
Figure 1 : Modèles du cerveau extrait.
(A) Série en couches de T1-QuickMPRAGE tranches coronal du cerveau de Monkey H. (B) Série en couches de tranches MR du cerveau extrait de Monkey H en utilisant le plugin BET et mango logiciel tel que décrit dans la section Méthodes. (C) Vue axiaque, sagittale et biaisée d’un modèle de la matière grise de Monkey H créé en utilisant la fonctionnalité de construction de surface dans Mango. (D) Vue axialle, sagittale et biaisée d’un modèle imprimé en 3D de la matière grise de Monkey H créé à l’aide d’une imprimante d’extruding Dremel 3D45. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Extraction du crâne.
(A) Série superposée de T1-QuickMPRAGE tranches coronale du cerveau de Monkey H. (B) Série superposée de masque binaire après de simples seuils tranches MR. (C) Série superposée de masque binaire après avoir supprimé « couche musculature ». (D) Série superposée de masque binaire du crâne après traitement tel que décrit dans la section Méthodes. (E) modèle 3D généré à partir d’un masque binaire. (F) modèle 3D avec craniotomie simulée enlevée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Préparation chirurgicale à l’aide de prototypes imprimés en 3D.
(A) Combinaison du cerveau imprimé en 3D extrait avec mangue à l’intérieur d’un crâne imprimé en 3D extrait de l’IRM de Monkey L tel que décrit dans la section Méthodes. (B) Comparaison du ciblage craniotomie entre nos modèles 3D et la planification MR dans Monkey L. ( C,D ) Un exempled’utilisationde notre boîte à outils pour se préparer à la chambre (C) et tableau (D) implantation15. (E) modèle imprimé 3D du crâne de Monkey L utilisé pour pré-flexion du poste de tête avant la chirurgie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Modélisation du cerveau en gel.
(A, B) modèle 3D du moule pour Monkey H. (C) moules imprimés 3D de A et B. Photo de gauche est un moule utilisé pour créer la partie supérieure de l’hémisphère droit. Sur la photo de droite est un moule pour créer l’hémisphère droit (D) Agarose modèles de la partie supérieure de l’hémisphère droit (à gauche) et tout l’hémisphère droit (droite). (E) Modèle Agarose de l’hémisphère droit placé à l’intérieur d’une impression 3D d’un crâne extrait de Monkey L, démontrant la représentation précise du cerveau et de la craniotomie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Modélisation par injection.
(A) Images time lapse de la procédure d’injection. Pré-insertion du panneau en haut à gauche. Panneau en haut à droite après l’insertion. Quatre panneaux inférieurs montrent la propagation du colorant au fil du temps. (B) Modèle de gel d’une section du cerveau positionnée dans un crâne imprimé en 3D avec une craniotomie de sorte que des injections de coloration alimentaire peuvent être observées par rapport aux structures corticales et au placement des électrodes. (C) impression 3D d’une chambre adaptée au crâne et observée par rapport au tableau d’électrodes, au modèle de gel et à l’injection. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichiers de codage supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article décrit une boîte à outils pour la préparation des neurochirurgies dans les PSN à l’aide de modèles physiques et CAO de l’anatomie du crâne et du cerveau extraits des scans MR.
Alors que les modèles de crâne et de cerveau imprimés en 3D et extraits ont été conçus spécifiquement pour la préparation des chirurgies de craniotomie et des implantations de poteaux de tête, la méthodologie se prête à plusieurs autres applications. Comme décrit précédemment, le modèle physique du crâne permet de pré-flexion du poteau avant la chirurgie, ce qui crée un bon ajustement avec le crâne. En outre, le crâne extrait de l’IRM peut être utilisé pour générer un poteau de tête conçu en 3D avec une fidélité plus élevée à l’anatomie du crâne. Tandis que l’imagerie de CT est traditionnellement une meilleure modalité pour l’extraction de crâne, dans la méthode proposée, l’anatomie de cerveau et de crâne viennent de la même modalité d’imagerie, qui pourrait contribuer à la cohérence anatomique accrue entre les modèles d’os et de tissu mou. Cette consistance anatomique pourrait améliorer la précision et s’assurer que la craniotomie couvrira la région corticale d’intérêt et que tous les composants d’implantation, tels que les chambres de stimulation et d’enregistrement, s’adaptent à la courbure du crâne. Ceci est soutenu par des études existantes qui ont quantitativement comparé la topographie de crâne MRI-extraite aux extractions d’autres types de balayage23,24. D’autres travaux sur le terrain ont décrit des méthodes pour la création de modèles et de prototypes imprimés en 3D pour l’implantation de la tête25,26, mais ils n’utilisent pas uniquement des scans MR pour créer un modèle adaptable pour la préparation à la fois pour l’affichage de la tête et la craniotomie. Il est important de noter que les paramètres d’acquisition de l’IRM utilisés ici sont essentiels à la réussite de l’extraction du crâne, tel que décrit dans le protocole. Les travaux antérieurs dans le domaine de l’extraction du cerveau et du décapage du crâne offrent des alternatives à l’extraction du cerveau BET largement disponible utilisée dans ceprotocole 27. De même, les scripts personnalisés d’extraction de crâne existent, cependant, ils exigent l’enlèvement manuel des voxels non-crâne comparés à un protocolecomplètement automatisé 28. Alors qu’ici nous ne montrons que quelques exemples, ces outils sont applicables à une variété d’autres chirurgies telles que l’électrode et les implantations de chambre dans NHPs2,4,5,7,10,15,18,29,30, ainsi que d’autres modèles animaux31,32.
Lorsqu’il est combiné avec les modèles de cerveau mélange agarose, la boîte à outils de préparation chirurgicale peut être appliquée pour se préparer à des interventions chirurgicales impliquant des injections de liquide tels que l’optogénétique et lachimiogénétique 2,4,5,10,33,34. Bien qu’ici nous avons eu le succès avec l’utilisation pla pour imprimer 3D les moules, ce processus peut être encore amélioré en utilisant un filament ABS, qui a une température de transition de verre plus élevé qui rendra le processus de moulage plus efficace. Des travaux antérieurs ont proposé le gel agarose comme matériau artificiel qui peut imiter certaines des propriétés mécaniques du cerveau pertinentes à l’infusionde liquide 20,21. Cependant, les travaux précédents n’ont pas combiné l’agarose avec un moule cerveau-réaliste pour fournir un outil chirurgical de préparation. Les cerveaux moulés de gel de mélange d’agarose peuvent être utilisés pour donner le contexte cortical qualitatif à l’emplacement d’injection et visualiser le volume et l’emplacement de la diffusion fluide. Les cerveaux de gel peuvent également être utilisés pour pratiquer le mouvement d’injection et l’emplacement dans le cadre stéréotaxique. Ceci peut être appliqué non seulement à l’optogénétique mais traduit dans d’autres expériences exigeant l’injection dans le cerveau2,4,34. Le modèle peut également être utilisé pour améliorer la pratique courante de la norme CED en optimisant la vitesse d’injection et l’épaisseur de la canule. Ce modèle peut également être renforcé par la validation quantitative du mélange de gel agarose pour représenter avec précision le flux diffusif et convectif dans lecerveau 5,10. Dans les efforts futurs, nous pouvons également intégrer des informations de vasculature dans nos modèles 3D en incluant l’imagerie contrastée à notre procédure d’imagerie qui peut fournir des informations critiques sur la planification de l’injection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer pour le moment.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par l’Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development des National Institutes of Health sous le numéro de prix K12HD073945, le Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), le Center for Neurotechnology (CNT, national Science Foundation Engineering Research Center sous Grant EEC-1028725) et l’University of Washington Royalty Research Funds. Le financement des laboratoires Macknik et Martinez-Conde pour ce projet provenait d’un prix BRAIN Initiative NSF-NCS 1734887, ainsi que des prix NSF 1523614 & 1829474, et des bourses d’études suny empire innovator scholarships à chaque professeur. Nous remercions Karam Khateeb pour son aide dans la préparation de l’agarose, et Toni J Huan pour son aide technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printing Software (GrabCAD Print) | Stratasys | Version 1.36 | Used for High quality 3D printing |
| 3D Printing Software (Simplify 3D) | Simplify3D | Version 4.1 | Used for PLA 3D printing |
| Agarose | Benchmark Scientific | A1700 | Used for making gel brains |
| Black Nail Polish | L.A. Colors | CNP637 | Used for gel molding |
| Cannula (ID 450 um, OD 666 um) | Polymicro Technologies | 1068150625 | Used to inject dye into gel brain |
| Catheter Connector | B Braun | PCC2000 | Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50 |
| Dremel 3D Digilab 3D45 printer | Dremel | F0133D45AA | Used for prototyping in PLA |
| ECOWORKS | Stratasys | 300-00104 | Used to dissolve QSR support structures |
| Erlymeyer flask | Pyrex | 4980 | Used for gel molding |
| Ethyl cyanoacrylate | The Original Super Glue Corp. | 15187 | Used to make combined cannula |
| Graduated cylinder | 3023 | Used for gel molding | |
| HATCHBOX PLA 3D Printer Filament | HATCHBOX | 3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK | 1kg Spool, 1.75mm, Red/Black |
| Locust Bean Gum | Modernist Pantry | 1018 | Gumming agent for gel brain mixtures |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Used for skull extraction |
| McCormick Yellow Food Color | McCormick | Used for dye injection | |
| Microwave | Panasonic | NN-SD975S | Used for agarose curing |
| MR Imaging Software (3D Slicer) | 3D Slicer | Version 4.10.2 | Used for 3D model generation |
| MR Imaging Software (Mango with BET plugin) | Reasearch Imaging Institute | Version 4.1 | Used for brain extraction |
| Philips Acheiva MRI System | Philips | 4522 991 19391 | Used to image non-human primates |
| Phosphate Buffered Solution | Gibco | 70011-044 | 10X diluted with DI water to 1X |
| Pump | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Pump driver | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Refrigerator | General Electric | Used to preserve agarose gel | |
| Scientific Spatula | VWR | 82027-494 | Used to extract gel molds |
| SolidWorks | Dassault Systemes | 2019 | |
| Stratasys ABS-M30 filament | Stratasys | 333-60304 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys F170 3D printer | Stratasys | 123-10000 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys QSR support | Stratasys | 333-63500 | Used to create supports with ABS model |
| Syringe | SGE | SGE250TLL | Used for dye injection |
References
- Phillips, K. A., et al.
- Macknik, S. L., et al. Advanced Circuit and Cellular Imaging Methods in Nonhuman Primates. Journal of Neuroscience. 39 (42), 8267-8274 (2019).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biol. 16 (8), 2005839 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in nonhuman primates. Elife. 7, (2018).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yao, Z., Yazdan-Shahmorad, A. A Quantitative Model for Estimating the Scale of Photochemically Induced Ischemic Stroke. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 2744-2747 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Sabes, P. N. Novel techniques for large-scale manipulations of cortical networks in nonhuman primates. Conference proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 5479-5482 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Han, X.
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- May, T., et al. Detection of optogenetic stimulation in somatosensory cortex by nonhuman primates--towards artificial tactile sensation. PLoS One. 9 (12), 114529 (2014).
- Griggs, D. J., K, K., Philips, S., Chan, J. W., Ojemann, W. K. S., Yazdan-Shahmorad, A. Optimized large-scale optogenetic interface for nonhuman primates. SPIE BiOS. , (2019).
- Khateeb, K., Griggs, D. J., Sabes, P. N., Yazdan-Shahmorad, A. Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Lucas, T. H., Fetz, E. E. Myo-cortical crossed feedback reorganizes primate motor cortex output. Journal of Neuroscience. 33 (12), 5261-5274 (2013).
- Jackson, A., Mavoori, J., Fetz, E. E. Long-term motor cortex plasticity induced by an electronic neural implant. Nature. 444 (7115), 56-60 (2006).
- Paxinos, G., Huang, X. F., Petrides, M., Toga, A. W. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates. 2nd Edition. , Elsevier Science. (2008).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Chen, Z. J., et al. A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies. Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).
- Cheng, H., et al. Prolonged operative duration is associated with complications: a systematic review and meta-analysis. Journal of Surgical Research. 229, 134-144 (2018).
- Michikawa, T., et al. Automatic extraction of endocranial surfaces from CT images of crania. PLoS One. 12 (4), 0168516 (2017).
- Soliman, A. S., et al. A realistic phantom for validating MRI-based synthetic CT images of the human skull. Medical Physics. 44 (9), 4687-4694 (2017).
- Blonde, J. D., et al. Customizable cap implants for neurophysiological experimentation. Journal of Neuroscience Methods. 304, 103-117 (2018).
- Overton, J. A., et al. Improved methods for acrylic-free implants in nonhuman primates for neuroscience research. Journal of Neurophysiology. 118 (6), 3252-3270 (2017).
- Lohmeier, J., Kaneko, T., Hamm, B., Makowski, M. R., Okano, H. atlasBREX: Automated template-derived brain extraction in animal MRI. Scientific Reports. 9 (1), 12219 (2019).
- Ortiz-Rios, M., et al. Improved methods for MRI-compatible implants in nonhuman primates. Journal of Neuroscience Methods. 308, 377-389 (2018).
- Nishimura, Y., Perlmutter, S. I., Eaton, R. W., Fetz, E. E. Spike-timing-dependent plasticity in primate corticospinal connections induced during free behavior. Neuron. 80 (5), 1301-1309 (2013).
- Seeman, S. C., Mogen, B. J., Fetz, E. E., Perlmutter, S. I. Paired Stimulation for Spike-Timing-Dependent Plasticity in Primate Sensorimotor Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1935-1949 (2017).
- Sedaghat-Nejad, E., et al. Behavioral training of marmosets and electrophysiological recording from the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 122 (4), 1502-1517 (2019).
- Schweizer-Gorgas, D., et al. Magnetic resonance imaging features of canine gliomatosis cerebri. Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 180-187 (2018).
- Galvan, A., et al. Nonhuman Primate Optogenetics: Recent Advances and Future Directions. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10894-10903 (2017).
- Galvan, A., Caiola, M. J., Albaugh, D. L. Advances in optogenetic and chemogenetic methods to study brain circuits in nonhuman primates. Journal of Neural Transmission. 125 (3), 547-563 (2018).
