Flypub tsay meyve etanol etkisi altında Drosophila melanogaster görüntüler sineği davranışları ölçer. Tsay kolayca her düzeyde deneyciler tarafından hakim olabilir ve çeşitli buharlaşmış uyaranlara uygulanabilir, madde bağımlılığı ve bağımlılık çalışmaları kolaylaştırmak.
Alkol kullanımı bozukluğu (AUD) toplumumuzda ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bağımlılık için etkili müdahaleler geliştirmek için, farklı deneysel yaklaşımlar ve model sistemlerine ihtiyaç duyulan temel nörobiyolojik mekanizmaları anlamak önemlidir. Alkollü içeceklerin ana bileşeni etanol, merkezi sinir sisteminde adaptif değişikliklere neden olur ve kronik alımı üzerine davranış. Davranışsal duyarlılık (yani, artan tepkiler) özellikle bağımlılığın altında yatan önemli bir adaptif değişimi temsil eder. Hayvan modellerinde etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmalarının çoğu etanolün lokomotor aktive edici etkisi üzerine yapılmıştır. Etanolönemli bir etkisi davranışsal disinhibition olduğunu. Ancak, etanolün disinhibition etkisine karşı davranışsal duyarlılık yeterince temsil edilememaktadır. Bu sorunu gidermek için, Biz Drosophila melanogastertekrarlayan etanol maruz kalma üzerine disinhibited kur faaliyetlerinde artan artış ölçmesağlayan Flypub titre geliştirdi. Burada, etanol maruziyet odalarının montajı, tahlil istasyonunun kurulumu, sinek bakımı ve toplama kriterleri, etanol teslimatı, engelsiz kur faaliyetlerinin sayısallaştırılması, veri işleme ve istatistiksel analiz dahil olmak üzere adım adım Flypub tahlillerini rapor ediyoruz. Ayrıca, kritik adımları gidermek için nasıl sağlanan sınırlamalar aşmak ve ek etanol kaynaklı davranışları değerlendirmek için yardımcı programı genişletmek. Drosophila melanogaster güçlü genetik araçlar ile birlikte Flypub tsay etanol kaynaklı davranışsal sensitizasyon altında yatan mekanizma keşfetmek görevi kolaylaştıracaktır.
Alkol dünyada en çok kullanılan ve yaygın olarak tüketilen ilaçlardan biridir. Bu kötüye kullanım ve bağımlılık için yüksek potansiyele sahiptir; ancak, bu sürecin altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Etanol disinhibition, öfori, bilişsel bozukluk, hiperaktivite, motor kontrol kaybı ve solucanlarsedasyon1, meyve sinekler1,2,3, fareler4, sıçanlar5 ve insanlar6, insanlar da dahil olmak üzere omurgasızlar için memelilere etanol etkileri aracılık ortak nörobiyolojik bileşenleri gösteren inhibe eder. Kronik etanol alımı aud altında yatan nöral adaptasyonlar ve davranışdeğişiklikleri neden olur. Adaptasyonlardan biri etanoltekrarlanandeneyimleri ile artırılmış tepki olarak tanımlanan davranışsal duyarlılık 7,8,9 veya diğer bağımlılık yapıcı maddeler10,11,12.
On yıllar boyunca, etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmaları (EIBS) lokomotor uyarıcı etkisi üzerinde duruldu, hangi bir öforik yanıt için bir proxy olarak kullanılır7,8,9,13. Örneğin, tekrarlanan üzerine sıçan veya fareler (her 24, 48 veya 72 saat) etanol yönetimi yürüme hızı8,14,15,,16,1717,18,19,20,21ile ölçülen artırılmış lokomotor aktivitesini görüntüler. Benzer şekilde, meyve sinekler etanol buharı ikinci maruz kalma tabi 4 saat ilk maruz kalma dan sonra gelişmiş lokomotor tepki sergi olarak yürüme hızı ile ölçülen yanı sıra22. Meyve sineklerinde lokomotor uyarıcı etkiye karşı AyİBS’nin altında yatan mekanizma hakkında bilgi bulunmamakla birlikte, sıçan ve fareler de çalışmalar moleküler ve sinyal bileşenleri ortaya çıkarmış (örneğin, dopamin, glutamat ve GABA sistemleri) yanı sıra nöral substratlar ve devre (örneğin, ventral tegmental alan, çekirdek accumbens, amigdala ve prefrontal korteks) EIBS için önemli roller oynamaktadır6,9,23.
Disinhibition etanol önemli bir etkisidir ve genellikle sınırlı davranışların tezahürü yol açar. Disinhibiting etkisi motor, duygusal, sosyal, cinsel ve bilişsel işlevler üzerinde uygulanan, hangi uygunsuz cinsel davranış, sözlü veya fiziksel saldırganlık ve dürtüsel eylemlere yol açabilir insan ve hayvan modellerinde24,25,26,27,28,29. Etanol kaynaklı disinhibisyon mekanistik çalışmalar için hayvan modellerinde araştırılmıştır ve onlar kemirgenler ve maymunlar da motor dürtüsellik ve saldırganlık yanı sıra solucanlar6,9,,24,28,29,30arama disinhibition içerir . Biz meyve sinekleri etanol etkisi altında cinsel davranış çekingen göstermek göstermiştir31. Özellikle, vahşi tip erkekler nadiren etanol31 olmadan diğer erkekler mahkeme uçar ve bunu, nazik aktif erkekler kur reddediyorum. Etanol etkisi altında, ancak, erkek sinekler diğer erkekler ve kur daha az reddi sergileyen karşı daha fazla kur göstermek, genel olarak geliştirilmiş intermale kur ile sonuçlanan. Özellikle, sinekler tekrarlayan etanol maruziyeti üzerine disinhibition etkisi davranışsal duyarlılık geliştirmek, Hangi EIBS31çalışma için benzersiz bir sistem olarak hizmet vermektedir,32.
Bu raporda, nasıl kurmak, gerçekleştirmek, sorun giderme ve etanol kaynaklı inhibisyon ve meyve sinek Drosophila melanogasterduyarlılık çalışma flypub analizi ve veri analiz açıklar. Faydasını ve etkinliğini sağlamak için, yaban tipi Kton-S ‘yi(CS; kontrol sinek suşu) ve ahtapotin (OA) sentezleyen tiramin β hidroksilaz (tβh) eksikliği olan sineklerle birlikte test ettik. OA omurgasızlar büyük bir nöromodülatör33,34 ve sinekler etanol toleransgelişiminde önemli bir rol oynar22. Burada ilk kez OA’nın EIBS için önemli olduğunu bildiriyoruz.
Bu raporda, Flypub testinin kurulum ve ayrıntılı protokolünü açıkladık; tekrarlayan etanol maruziyetinin, çekingen kur ve davranışsal duyarlılığı nasıl tetiklediğini ölçmek için yeni bir yöntem. Flypub tahsini nispeten basit olmasına rağmen, güvenilir sonuçlar elde etmek için birkaç adım dikkat ve dikkat gerektirir. İlk olarak, test için sinekler tamamen pigmentli olmalıdır (yani, tamamen gelişmiş yetişkin sinekler), sağlıklı ve bozulmamış. Özellikle kanatlarında veya bacaklarında oluşan deformiteler veya hasarlar erkeğin mahkeme yeteneğini etkileyebilir. İkinci olarak, sinek yaşı önemlidir ve kontrol ve deneysel gruplar arasında eşleşmelidir (optimal yaş: 3-5 gün etanol maruziyeti 1). İki hafta ve daha yaşlı vahşi tip erkek sinekler disinhibited kur yüksek seviyelerde görüntülemek eğilimindedir31. Bu nedenle, çalışma altında sineklerin uygun yaş eşleştirme değişken sonuçlar önlemek için esastır. Üçüncü olarak, pub başına sinek sayısı hayati önem taşımaktadır (optimal: pub başına 33). Pub başına daha düşük veya daha yüksek sinek numaraları büyük ölçüde kur puanları çarpık olabilir (veriler gösterilmez). Dördüncü olarak, Flypub odaları Şekil 2B’degösterildiği gibi aynı hacimlere sahip olması gerekir. Bu, sineklerin eşzamanlı olarak etanol buharı almasını ve ortaya çıkan davranışların tutarlı olmasını sağlar. Beşinci olarak, net video kaydı ve kesin kur puanlama esastır. Bu protokol ağır davranışsal gözlemlere bağlıdır, bu nedenle standart kur puanlama protokolüne titiz bir şekilde uyulması tutarsız sonuçları en aza indirmek için temeldir. Son olarak, hem etanol maruziyeti hem de kur puanlama adımlarının körü körüne yapılması tavsiye edilir, deneyci sinek genotiplerinden veya deneysel tedavilerden habersizdir ve bu da deneysel önyargıyı önler.
Flypub testinin birçok avantajı vardır. İlk olarak, birden fazla sinek grubu aynı anda test edilebilir ve karşılaştırılabilir. İkinci olarak, ucuz, kurulumu basit ve öğrenmesi kolay, lise, lisans ve yüksek lisans öğrencileri, doktora ve fakülte ile sınırlı alan ve bütçeleri ile öğretim laboratuvarları ile ilköğretim de dahil olmak üzere her düzeyde deneyciler için son derece münasip hale. Üçüncü olarak, bu kadın sinekler ve etanol veya diğer yatıştırıcı yatıştırıcı yatıştırıcı etkisi ilk duyarlılık ve tolerans geliştirme ve bakım değerlendirmek için sedatif etkisi gibi ek davranışları ölçmek için kullanılabilir31,32. Flypub, AUD’un çeşitli özelliklerini birlikte incelemek için çok yönlü bir yöntemdir.
Flypub testinin en büyük sınırlaması sıkı ve zahmetli kur puanlama rejimidir. Etanol etkisi altında kur davranışı kur süresi az bir saniyeden birkaç dakika arasında değişmektedir ve kur yapan sinekler oldukça sık değişiyor bir şekilde son derece dinamiktir. Burada sunulan puanlama rejimi ve bu dinamik doğa dahil etmek için belirli bir genotip31,,32için bireysel etanol pozlama tutarlı puanları sağlamak için geliştirilmiştir. Protokolde belirtildiği gibi, kur yapma faaliyeti elle puanlandırılır, bu da zaman alıcıdır. Birkaç otomatik puanlama programları tarafsız yüksek iş bölümü davranış tarama kolaylaştırmak için geliştirilmiştir ve bunların hepsi bireysel sinek ‘hareketleri ve yerleri39,40,41,42,43,44,45güveniyor . Ayrıca kur yapma etkinliğini otomatik olarak saymak için bir bilgisayar yazılımı geliştirmeye çalıştık ancak tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde edemedik. Bu davranışsal puanlama birden fazla kur adımları (yani, aşağıdaki, tek taraflı kanat uzatma, karın bükme ve montaj)35,36,aynı anda birden fazla sinek46 içerir gerçeği nedeniyle olabilir. Bu sınırlama ya da olsa, yeterli eğitime sahip bir deneyci, etanol kaynaklı kur davranışlarını tutarlılık ve doğrulukla ölçebilmelidir. Yine de, bir takip olarak makine öğrenimi veya diğer gelişmiş algoritmalar benimsemek için büyük yardım ve önem olacaktır.
Kemirgen modelleri ne kadar benzer, sinek modelinde etanol üzerinde yapılan çalışmalar büyük ölçüde etanolün lokomotor uyarıcı ve sedatif etkileri üzerinde yoğunlaşmış. Flypub tsay ancak, önlemler disinhibited kur, roman31olan bilişsel disinhibition bir tür,32. Bu nedenle, Flypub moleküler oyuncular, hücresel yollar ve sinir devreleri yanı sıra risk faktörleri (örneğin, yaş, uyku, diyet veya sosyal çevre) davranışsal çekingenlik ve duyarlılık için kritik açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir. Daha önce dopamin sinyalizasyonu eibs için gerekli olduğunu göstermiştir, hangi kemirgen modelleri ve insan deneklerde bulgular doğrultusunda6,9,31. Ayrıca kavram kanıtı olarak, biz tβh mutant OA eksik inceledi (norepinefrin omurgasız meslektaşı) ve oa etanol disinhibition etkisi davranışsal sensitizasyon için de önemli olduğunu bulundu katkısı dopamin göre nispeten küçük olmasına rağmen31. Bu bulgu Scholz47 tarafından tβh mutant sinekler etanol lokomotor aktivasyon etkisi47sensitizasyon belirgin bir bozukluk sergilemek gözlem aksine . Bu farklı moleküler düşündürmektedir, hücresel ve nöral yollar lokomotor aktivasyon karşı disinhibition davranışsal duyarlılık aracılık. Takip çalışmaları bu tantalizing kavramı daha da işbirliği gerekir.
Özetle, Flypub düşük maliyetli, çok yönlü ve etkili bir yöntem etanol davranışsal tepkileri araştırmak için, özellikle disinhibition ve davranışsal duyarlılık, aud anlayışımızı ilerletmek ve bu kronik bozukluk için etkili müdahaleler hakkında fikir sağlamak yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD ve NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster hibeleri tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Nih tarafından finanse edilen RISE programına (NIGMS 5R25GM069621) NMD ve CMS’yi, NMD’yi destekleyen UTEP COURI-SURPASS programını, NIH tarafından finanse edilen MARC programına (NIGMS 2T34GM008048-31) AA’yı ve EBS’yi desteklemek için Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship’i desteklemekiçin müteşekkiriz. Biz büyük ölçüde UTEP iletişim departmanı için teşekkür ederiz: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez ve Müzik departmanı: Stephen A. Haddad video ve seslendirme üretim onların yardım için. Son olarak, Dr Andreas Thum kontrol Kton-S uçar ile birlikte Kton-S arka plan içinde tβh mutant paylaştığı için çok müteşekkiriz; ve Jessica Burciaga tartışma ve destek için ahtapotamin ve Han laboratuvar üyeleri üzerinde ilk çalışmalara yaptığı değerli katkı için.
95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
Canton-S | – | – | wild-type strain used as a control |
Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
Excel | Microsoft | – | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
Microsoft LifeCam software | Microsoft | – | version 3.60; to videotape flypubs |
Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
Minitab 17 | Minitab | – | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | – | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
Plastic funnel – mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
Plastic funnel – small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
Polycarbonate sheet | Lexan | – | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
Time code | – | – | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
Tyramine b hydroxylase (tbh) | – | – | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
VLC media player | VideoLAN | – | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |