En Doxorubicin-indusert murine modell av utvidet kardiomyopati In Vivo

Summary

Beskrevet er en protokoll for å etablere en Doxorubicin-indusert utvidet kardiomyopati (DCM) modell hos mus via langsiktig intraperitoneal injeksjon av Doxorubicin.

Abstract

Utvidet kardiomyopati (DCM) refererer til et spekter av heterogene myokardforstyrrelser preget av ventrikulær dilatasjon og deprimert hjerteytelse i fravær av hypertensjon, valvulær, medfødt eller iskemisk hjertesykdommer, og som kan være relatert til infeksjon, autoimmune eller metabolske abnormiteter eller familiearv. Det kan utvikle seg til kongestiv hjertesvikt med dårlig prognose. Doxorubicin (Dox) er mye ansatt som et kjemoterapeutisk stoff, men bruken er begrenset fordi det forårsaker DCM-lignende endringer i myokardiet. Dens myokardtoksisitet tilskrives oksidativt stress, kronisk betennelse og kardiomyocytt apoptose. Det er ikke etablert en modell for DCM som utnytter disse Dox-induserte DCM-symptomene.

Introduction

En av de vanligste årsakene til hjertesvikt, DCM er preget av ventrikulær dilatasjon og redusert hjertefunksjon og er den vanligste årsaken til hjertetransplantasjon over hele verden¹. For å undersøke patogenesen ytterligere og finne effektive behandlinger, er tilgang til modne dyremodeller spesielt viktig. Formålet med de beskrevne eksperimentene er å etablere en stabil musemodell av DCM som ligner menneskelig DCM.

På grunn av den komplekse patogenesen av DCM er det mange forskjellige metoder for å lage tilsvarende dyremodeller. Spontane DCM-modeller² er relativt stabile, men de er dyre og ikke lett tilgjengelige. Genmodifiserte dyremodeller³ er ikke veletablerte og krever mer eksperimentell bruk. DCM dyremodeller indusert av virusinfeksjon⁴ eller autoimmune feil⁵ er enkle å få tak i, men de er ikke helt representative for DCM. Modeller assosiert med myokardtoksisitet inkluderer alkoholinduserte DCM-modeller og Dox-induserte DCM-dyremodeller.

Den Dox-induserte kardiomyopati-modellen oppnås ved intraperitoneal injeksjon av Dox⁶. Modellen utnytter den mest alvorlige kroniske bivirkningen av Dox: Etter Dox-eksponering utvikler pasienter sen start DCM-symptomer med klinisk ensartethet⁷. Dox-indusert oksidativt stress⁸ og mitokondrieskade⁹, som fører til kardiomyocytt apoptose, er symptomer i patogenesen av DCM. Det er akutte og kroniske Dox behandlingsmodeller: en enkelt høy dose Dox (15 mg / kg) induserer en kortsiktig modell for kardiomyopati¹⁰, mens repeterende lavdose Dox injeksjoner (seks ukentlig, 3 mg / kg) indusere en langsiktig modell for kardiomyopati¹¹. Basert på den presenterte studien injiserte villtypemus intraperitonealt en gang i uken i en dose på 5 mg / kg skjermmorfologi og histologi i hjertet i samsvar med egenskapene til DCM ved slutten av behandlingen, noe som gir en ideell måte å etablere en DCM-modell på.

Protocol

Dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Forberedelse av reagenser og dyr

1. Løs opp doksorubicinhydroklorid (Pfizer, USA) i sterilisert vann. Vortex for å oppnå en Dox-oppløsning på 1 mg/ml og holde ved 4 °C.
2. Bruk C57BL/6 mus (8–10 uker gamle; 25–30 g vekt). For denne studien ble mus kjøpt fra Model Animal Research Center ved Nanjing University og holdt i dyrerommet til Nanjing Drum Tower Hospital.
3. Patogenfrie musebur ble opprettholdt under en 12 timers lys/ mørk syklus ved en konstant temperatur på 23 °C. Alle dyrene ble matet på en vanlig chow diett og fikk mat og vann ad libitum.

2. Etablering av DCM dyremodell

1. Tilfeldiggjøre mus til en normal (n = 5) gruppe og Dox (n = 5) gruppe.
2. Administrer Dox-oppløsningen intraperitonealt i en dose på 5 mg/kg ved hjelp av en 1 ml sterilisert sprøyte 1x i uken for Dox-gruppen. Behandle kontrollmusene på samme måte med samme mengde saltløsning.
3. Mål kroppsvekten til de to gruppene ukentlig. Juster derfor injeksjonsdosen basert på kroppsvekt ukentlig i totalt 4 uker, med en kumulativ dose på 20 mg/kg (figur 1).
   MERK: En tidsperiode på 4 uker ble valgt fordi ekkokardiografi ved 4 uker viste en signifikant forskjell i hjertefunksjon mellom de to gruppene.

3. Ekkokardiografisk undersøkelse

1. På slutten av den fjerde uken, utfør en ekkokardiografisk undersøkelse av musene.
2. Bedøv musene med 2% isofluran intranasalt. Hvis musene ikke reagerer på en klype av huden med en tannet pinsett eller stimulerer tærne og halene, fortsett med protokollen.
3. Plasser musen på en dyrehåndteringsplattform i liggende stilling. For å opprettholde anestesi, dekk dyrets nese og munn med en nesekjegle og lever 2% isofluran.
   MERK: For IP-anestesi, injiser 4% klorhydrat i en dose på 0,2 ml / 20 g.
4. Fjern brystpels forsiktig med en elektrisk barbermaskin. Vurder hjertefunksjon in vivo ved hjelp av transthoracic ekkokardiografi.
5. Utfør LV-ekkokardiogrammet i både parasternale langakse- og kortaksevisninger med en bildefrekvens på henholdsvis 233 Hz. Endesystoliske og enddiastoliske dimensjoner ble definert som fasene som tilsvarer henholdsvis EKG T-bølgen og R-bølgen.
6. På M-modus-sporene måler du den gjennomsnittlige LV-end-systoliske diameteren (LVIDd), LV-enddiastolisk diameter (LVIDs), interventrikulær septaltykkelse (IVS) og LV-bakre veggtykkelse (LVPW) fra 3-5 hjerteslag. Beregn også utkasterfraksjonen (EF) og brøkforkortelsen (FS) basert på ekkokardiografi.

4. Histologisk farging

1. Etter ekkokardiografisk analyse, ofre musene ved intraventrikulær injeksjon av 10% kaliumklorid.
2. Perfuse hjertet med ca 30 ml saltvann etter disseksjon til leveren og lungen blir blek.
3. Slukk hjertet og vask det grundig i fosfatbufferløsning for å ekstrudere blod.
4. Fest hjertet i 4% formalin ved romtemperatur i 24 timer og behandle vevet i en parafinboks slik at parafinvoksen avkjøles og størkner.
5. Klipp hjertene i 5 μm tykke skiver for patologisk farging.
6. Dewax og rehydrere seksjoner som inneholder papillær muskel.
   1. Inkuber lysbilder ved 55 °C i 30 minutter. Deretter inkuberer du i xylen 2x i 2 min hver; 100% etanol 2x i 2 min hver; 95% etanol 2x i 2 min hver; 80% etanol i 2 min; 75% etanol i 2 min; og 50% etanol i 2 min.
7. Flekk ved bruk av hematoksylin og eosin (H&E) samt Massons flekk.

Representative Results

Hjertefunksjon
Utvidet kardiomyopati er preget av progressiv ventrikulær dilatasjon og kontraktil dysfunksjon. Figur 2 viser representative ekkokardiografiske bilder av de to gruppene. Dox-behandlede mus viste markert redusert venstre ventrikulær ejeksjonsfraksjon og venstre ventrikulær fraksjonal forkortelse (Figur 3A,B). LV-diameteren økte også i både diastoliske og systoliske faser (Figur 3C,D). Dette viste at Dox-behandlede mus hadde nedsatt hjertefunksjon.

Histologisk farging
Patologisk farging ble utført for å observere de patologiske endringene av saltvannsbehandlede mus og Dox-behandlede mus. Myokardfibre av musene i kontrollgruppen ble pent arrangert, uten å infiltrere leukocytter. I Dox-gruppen ble myokard myofibere forstyrret og ødelagt, og kardiomyocytter var mindre og tynnere (figur 4A). Massonfarging viste at Dox-behandlede mus hadde mer interstitiell fibrose (Figur 4B).

Figur 1: Skjematisk diagram over en Dox-indusert utvidet kardiomyopati. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Ekkokardiografien til de to gruppene. (A) Kontrollgruppe; (B) Dox-gruppe. Venstre er langaksedelen, og høyre er kortaksedelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Hjertefunksjonsvariablene mellom gruppene. (A) EF; (B) FS; (C) LVEDd; (D) LVEDer. *P < 0,05, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Histologisk farging. (A) H&E farging; (B) Masson farging. Venstre er kontrollgruppen, og høyre er Dox-gruppen. Den øvre pilen viser at Dox-behandlede kardiomyocytter var mindre og tynnere og myofibers var uorden og ødelagt. Den nedre pilen betegner tilstedeværelsen av interstitiell fibrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5

Discussion

Dox er et ikke-spesifikt periodisk antitumor kjemoterapi legemiddel som vanligvis brukes i klinisk praksis¹². Dens viktigste bivirkning er kardiotoksisitet, preget av kardiomyopati og påfølgende hjertesvikt¹³. Den underliggende mekanismen inkluderer skade på myokard lipidperoksidasjon, hemming av myokardsalkoplasmatisk retikulum Ca²⁺-ATPase-aktivitet, og aktivering av det myokardiale lokale renin-angiotensin-systemet, noe som resulterer i økt AT II-produksjon og intracellulær kalsiumoverbelastning¹⁴. På grunn av den dødelige effekten av en stor dose intraperitoneal injeksjon av Dox, ble en alternativ måte å etablere en pålitelig modell brukt i denne protokollen.

DCM-modellen etablert ved denne metoden er svært lik patogenesen av menneskelig DCM. I tillegg til hjertesvikt ble den vanligste komplikasjonen av Dox, ascites observert hos DCM-mus. Derfor, under modellutvikling, bør det tas hensyn til steril drift og rettidig utskifting av sprøyter. I tillegg, for Dox-dosen, ble to administrasjonsmetoder sammenlignet: et langt behandlingsforløp ved hjelp av en liten dose, og kortsiktig behandling med høy dose. Resultatene viser at kontinuerlig injeksjon av Dox ved 5 mg/kg i fire uker kan resultere i en nøyaktig modell av DCM, lavere musdødelighet og kortere tid for modellidetablering.

Oppsummert kan en stabil, pålitelig og økonomisk mus DCM dyremodell med hell etableres ved intraperitoneal injeksjon av Dox. Denne forskningen gir en ideell modell for å studere DCM. Det vil bidra til å avsløre patogenesen av utvidet kardiomyopati eller kronisk hjertesvikt og utforske nye legemidler eller behandlinger for fremtidige kliniske applikasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB