Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

Summary

Her etablerte vi en lav pris og enkel å betjene metode som leder rask og effektiv differensiering fra embryonale stamceller til nevroner. Denne metoden er egnet for popularisering blant laboratorier og kan være et nyttig verktøy for nevrologisk forskning.

Abstract

Den nevrale differensieringen av mus embryonale stamceller (mESCs) er et potensielt verktøy for å belyse de viktigste mekanismene som er involvert i nevrogenese og potensielt hjelpe til med regenererende medisin. Her etablerte vi en effektiv og rimelig metode for nevronal differensiering fra mESCs in vitro, ved hjelp av strategien for kombinatorisk screening. Under betingelsene som er definert her, tillater den 2-dagers embryoide kroppsdannelsen + 6-dagers retinosyreinduksjonsprotokoll rask og effektiv differensiering fra mESCer til nevrale forløperceller (NPCer), sett ved dannelsen av godt stablet og neurittlignende A2lox og 129 derivater som er Nestin-positive. Den sunne tilstanden til embryolegemer og tidspunktet da retinsyre (RA) påføres, samt RA-konsentrasjonene, er kritiske i prosessen. I den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner, kunne N2B27 medium II (supplert med Neurobasal medium) bedre støtte det langsiktige vedlikeholdet og modningen av nevronale celler. Den presenterte metoden er svært effektivitet, lave kostnader og enkel å betjene, og kan være et kraftig verktøy for nevrobiologi og utviklingsbiologi forskning.

Introduction

Embryonale stamceller (ESCer) er pluripotente og kan differensiere til nevrale forløperceller (NpCer) og deretter inn i nevroner under visse forhold¹. ESC-basert nevrogenese gir den beste plattformen for å etterligne nevrogenese, og fungerer dermed som et nyttig verktøy for utviklingsbiologistudier og potensielt hjelp til regenerativ medisin^2,3. I de siste tiårene har mange strategier blitt rapportert for å indusere embryonal nevrogenese, for eksempel den transgene^{metoden 4}, ved hjelp av små^{molekyler 5}, ved hjelp av et 3D-matrisemikromiljø⁶, og co-kulturteknikken⁷. Imidlertid er de fleste av disse protokollene enten tilstandsbegrenset eller vanskelig å betjene, og dermed er de ikke egnet for bruk i de fleste laboratorier.

For å finne en enkel å betjene og lav pris metode for å oppnå effektiv neural differensiering fra mESCer, ble en kombinatorisk screeningstrategi brukt her. Som beskrevet i figur 1ble hele prosessen med embryonisk nevrogenese delt inn i 2 faser. Fase I refererer til differensieringsprosessen fra mESCer til NPCer, og fase II er relatert til den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner. Basert på prinsippene for enkel drift, lave kostnader, lett tilgjengelige materialer og høy differensieringseffektivitet, ble syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt basert på det tradisjonelle tilhengerkultursystemet eller embryoid^{kroppsdannelsessystem 8,9}. Differensieringseffektiviteten til protokoller i begge faser ble evaluert ved hjelp av cellemorfologiobservasjon og immunofluorescence analyse. Gjennom å kombinere den mest effektive protokollen i hver fase, etablerte vi den optimaliserte metoden for neural differensiering fra mESCer.

Protocol

1. Mus embryonale stamcellekultur Forbered 0,1% gelatinbelagte cellekulturretter eller tallerkener. Tilsett 2 ml sterilisert 0,1% gelatin (0,1% w / v i vann) til 60 mm cellekulturretter. Rock forsiktig for å sikre jevn belegg av cellekulturretter. Legg oppvasken i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C og la belegget i 1 time. Fjern 0,1% gelatinoppløsning før du sår cellene.MERK: Etter at du har fjernet gelatinen, er det ikke nødvendig å tørke eller vaske de belagte r…

Representative Results

2-dagers embryoid kroppsdannelse + 6-dagers RA induksjon fungerer best på å lede differensiering av mESCer i NPCer (fase I). For å finne den optimale protokollen som best fremmer differensieringen av mESCer i NPCer (fase I), ble 7 protokoller testet på både A2lox og 129 mESCer (tabell 1) og differensieringsstatusen for hver gruppe ble overvåket ved hjelp av lysmikroskop. Som vist i figur 3Aviste de fleste A2lox- og 129 derivater under “2-dagers embryofødt kroppsdannel…

Discussion

I den nåværende studien etablerte vi en enkel og effektiv metode for nevronal differensiering fra mESCer, med lave kostnader og lett oppnådde materialer. I denne metoden kan 2 dager med embryoid kroppsdannelse etterfulgt av 6 dager med RA-induksjon effektivt fremme differensiering av mESCer i NPCer (fase I-protokoll 3). For fase II differensiering induserer N2B27 medium II (Fase II-protokoll 3) mest effektivt differensieringen fra NPCer til nevroner. For å sikre suksess, bør mer oppmerksomhet rettes mot flere kritis…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650