Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

Sommario

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Abstract

La differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali del topo (mESC) è un potenziale strumento per chiarire i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi e potenzialmente aiutare nella medicina rigenerativa. Qui, abbiamo stabilito un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dagli mESC invitro, utilizzando la strategia dello screening combinatorio. Nelle condizioni qui definite, la formazione del corpo embrionale di 2 giorni + il protocollo di induzione dell'acido retinoico di 6 giorni consente una differenziazione rapida ed efficiente dagli MESC alle cellule precursori neurali (NPC), come visto dalla formazione di derivati A2lox e 129 ben impilati e simili a neurite che sono positivi alla Nestin. Lo stato sano dei corpi embrioidi e il momento in cui viene applicato l'acido retinoico (RA), così come le concentrazioni di RA, sono fondamentali nel processo. Nella successiva differenziazione dai NPC ai neuroni, N2B27 medium II (integrato da mezzo neurobasale) potrebbe supportare meglio il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Il metodo presentato è altamente efficienza, a basso costo e facile da usare e può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono pluripotenti e possono differenziarsi in cellule precursori neurali (NPC) e successivamente in neuroni in determinate condizioni¹. La neurogenesi basata su ESC fornisce la migliore piattaforma per imitare la neurogenesi, fungendo così da strumento utile per gli studi di biologia dello sviluppo e potenzialmente aiutare nella medicina^{rigenerativa 2,3}. Negli ultimi decenni, sono state riportate molte strategie per indurre la neurogenesi embrionale, come il metodo transgenico^{4, utilizzando}piccole^{molecole 5,....}

Protocollo

1. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo

1. Preparare piatti o piatti di coltura cellulare ricoperti di gelatina 0,1%.
   1. Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% w/v in acqua) a piatti di coltura cellulare da 60 mm. Dondolare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle stoviglie di coltura cellulare.
   2. Mettere i piatti in un incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C e lasciare il rivestimento per 1 h.
   3. Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% prima di seminare le cellule.
      NOTA: Dopo aver rimosso la gelatina, non è necessario asciugare o lavare i piatti rivestiti.

Risultati

La formazione del corpo embrionale di 2 giorni + l'induzione ra di 6 giorni funziona meglio per dirigere la differenziazione degli MESC in NPC (Fase I). Per determinare il protocollo ottimale che promuove meglio la differenziazione degli MESC in NPC (fase I), sono stati testati 7 protocolli sia su A2lox che su 129 mESC(tabella 1)e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando il microscopio a luce. Come mostrato nella figura 3A, la maggior par.......

Discussione

Nel presente studio, abbiamo stabilito un metodo semplice ed efficace per la differenziazione neuronale dagli mESC, con materiali a basso costo e facilmente ostruibili. In questo metodo, 2 giorni di formazione del corpo embrionale seguiti da 6 giorni di induzione ra possono promuovere efficacemente la differenziazione degli MESC in NPC (protocollo di fase I 3). Per la differenziazione di fase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induce più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni. Per garantire il succes.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-nestina [Rat-401]	Abcam	Ab11306	conservato a -80 ° C, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti
Anti-beta;-Tubulina III anticorpo prodotto nel coniglio	Sigma Aldrich	T2200	conservato a -80 ° C, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	conservato a -20 ° C e proteggere dalla luce
B-27 Integratore (50X), senza siero	Gibco	17504044	conservato a -20 ° C, e proteggere dalla luce
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	conservato a -20 ° C
Vetrini	coprioggetti NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	conservato a -20 ° C e proteggere dalla luce
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	conservato a 4 gradi; C
Siero fetale bovino	HyClone	SH30084.03	conservato a -20 ° C, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti
Microscopia a fluorescenza	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	conservati a temperatura ambiente
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	conservati a 4 gradi; C
Immunol Staining Tampone di diluizione dell'anticorpo primario	Beyotime	P0103	conservato a 4 gradi C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	conservato a 4 gradi C
KnockOut Siero di Ricambio	Gibco	10828028	conservato a -20 gradi C, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti
fattore inibitorio della leucemia Sigma		L5283	umano conservato a -20 ° C
Mezzo di montaggio con DAPI - Acquoso, Fluoroshield	Abcam	ab104139	conservato a 4 gradi; C e proteggere dalla luce
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali	Gibco	11140076	conservato a 4 gradi C
Supplemento N-2 (100X)	Gibco	17502048	conservato a -20 gradi; C e proteggere dalla luce
Siero di capra normale	Jackson	005-000-121	conservato a -20 ° C
Neurobasal	Medium Gibco	21103049	conservato a 4 gradi C
Piastra batterica non adesiva	Corning	3262
Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)	HyClone	SH30256.01B	conservato a 4 gradi; C
Penicillina/ Streptomicina Soluzione	HyClone SV30010		conservato a 4 gradi C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	conservato a -20 ° C
Acido retinoico	Sigma	R2625	conservato a -80 ° C e proteggere dalla luce
Ceppo 129 Cellule staminali embrionali di topo	Cyagen	MUAES-01001	Mantenuto nel sistema di coltura senza alimentatore
Stem-Cellbanker (senza DMSO)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	conservato a -20 ° C, evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti
Tripsina 0,25% (1X) Soluzione	HyClone	SH30042.01	conservata a 4 gradi; C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	conservato a 4 gradi; C e proteggere dalla luce
4% paraformaldeide	Beyotime	P0098	conservato a -20 ° C
6 piastre a pozzetti	Corning	3516
Piastra per colture cellulari da 60 mm	Corning	430166
Provetta da centrifuga da 15 ml	NUNC	339650

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