小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

Summary

在这里，我们建立了一种低成本和易于操作的方法，将胚胎干细胞快速高效分化为神经元。该方法适用于实验室的推广，是神经学研究的有用工具。

Abstract

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经生成的关键机制并可能有助于再生医学的潜在工具。在这里，我们建立了一种高效和低成本的神经元分化方法，从mESC体外， 使用组合筛选的策略。根据此处定义的条件，2 天胚胎体形成 – 6 天视网膜酸诱导协议允许从 mESC 快速有效地分化为神经前体细胞 （NPC），如形成堆叠良好和中性状 A2lox 和 129 个内斯汀阳性衍生物所示。胚胎体的健康状态和使用网膜酸 （RA） 的时间点以及 RA 浓度在此过程中至关重要。在随后从NPC向神经元的分化中，N2B27中II（辅以神经基质介质）可以更好地支持神经元细胞的长期维持和成熟。该方法效率高、成本低、操作方便，是神经生物学和发育生物学研究的有力工具。

Introduction

胚胎干细胞（ESCs）是多能的，可以分化成神经前体细胞（NPC），随后在某些条件下进入神经元^1。基于ESC的神经生成提供了模仿神经生成的最佳平台，从而作为发展生物学研究的有用工具，并可能有助于再生医学^2，3。在过去的几十年里，许多诱导胚胎神经生成的策略被报道，如转基因方法^4，使用小分子^5，使用3D矩阵微环境^6，和共生技术^7。但是，这些协议大多条件有限或难以操作，因此不适合在大多数实验室中使用。

为了找到一种操作简单、成本低廉的方法，实现与 mESC 的有效神经分化，这里使用了组合筛查策略。如图1所述，胚胎神经生成的整个过程分为两个阶段。第一阶段是指从 mESC 到 NPC 的分化过程，第二阶段涉及从 NPC 到神经元的后续分化。基于操作方便、成本低、材料易用、分化效率高的原则，根据传统的单层培养系统或胚胎体形成系统^8、9，选择了第一阶段的7个协议和第二阶段的³个协议。利用细胞形态观察和免疫荧光检测，评估了两个阶段协议的分化效率。通过结合每个阶段最有效的协议，我们建立了神经分化与 mESC 的优化方法。

Protocol

1. 小鼠胚胎干细胞培养 准备 0.1% 明胶涂层细胞培养皿或盘子。 加入2 mL的灭菌0.1%明胶（0.1%w/v在水中）到60毫米细胞培养皿。轻轻摇动，确保细胞培养皿均匀涂层。 将菜肴放入 37 °C 下的 5% CO2 孵化器中，并允许涂层 1 小时。 在播种细胞之前取出0.1%的明胶溶液。注意：去除明胶后，无需干燥或清洗涂层的盘子。 小鼠胚胎干细胞（A2lox和129?…

Representative Results

2 天胚胎体形成 + 6 天 RA 感应最能指导 MESC 分化到 NPC （第一阶段）。为了确定最能促进将 mESC 分化为 NPC（第一阶段）的最佳方案，在 A2lox 和 129 mESC （表 1）上测试了 7 个协议，并使用光显微镜监测了每个组的分化状态。如 图3A所示，在”2天胚胎体形成+6天RA诱导”治疗下，大多数A2lox和129个衍生物（第一阶段协议3）显示堆积良好和中性状形态，这表明NPC的形成。?…

Discussion

在本研究中，我们建立了一种简单而有效的神经元分化方法，具有成本低、材料易用等功能。在这种方法中，2天的胚胎体形成，然后是6天的RA诱导，可以有效地促进mESC在NPC中的分化（第一阶段协议3）。对于二期分化，N2B27介质II（II-协议3）最有效地诱导从NPC分化为神经元。为确保成功，应更多地注意几个关键步骤。

首先，胚胎体的健康状态是整个分化过程的关键。三维胚胎…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650