Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Summary

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Abstract

Die neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen (mESCs) ist ein mögliches Werkzeug zur Aufklärung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese und potenzieller Hilfe in der regenerativen Medizin. Hier haben wir eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitroetabliert, mit der Strategie des kombinatorischen Screenings. Unter den hier definierten Bedingungen ermöglicht die 2-tägige embryoide Körperbildung + 6-Tage-Retinoinsäure-Induktionsprotokoll eine schnelle und effiziente Differenzierung von mESCs in neuronale Vorläuferzellen (NPCs), wie die Bildung von gut gestapelten und neuritigen A2lox- und 129 Derivaten sieht, die Nestin-positiv sind. Der gesunde Zustand von embryoiden Körpern und der Zeitpunkt, an dem Retinsäure (RA) angewendet wird, sowie die RA-Konzentrationen sind dabei von entscheidender Bedeutung. In der anschließenden Differenzierung von NPCs in Neuronen könnte N2B27 medium II (ergänzt durch Neurobasal medium) die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellen besser unterstützen. Die vorgestellte Methode ist hochgradig effizient, kostengünstig und einfach zu bedienen und kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.

Introduction

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent und können sich unter bestimmten Bedingungen in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) und anschließend in Neuronen differenzieren¹. ESC-basierte Neurogenese bietet die beste Plattform, um Neurogenese zu imitieren, und dient somit als nützliches Werkzeug für Entwicklungsbiologie-Studien und potenziell Hilfe in der regenerativen Medizin^2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Strategien zur Induktion der embryonalen Neurogenese berichtet, wie die transgene Methode⁴, mit kleinen Molekülen⁵, mit einer 3D-Matrix-Mikroumgebung⁶, und die Co-Kultur-Technik⁷. Die meisten dieser Protokolle sind jedoch entweder bedingt oder schwer zu bedienen, daher sind sie für den Einsatz in den meisten Laboratorien nicht geeignet.

Um eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zu finden, um eine effiziente neuronale Differenzierung von mESCs zu erreichen, wurde hier eine kombinatorische Screening-Strategie verwendet. Wie in Abbildung 1beschrieben, wurde der gesamte Prozess der embryonalen Neurogenese in 2 Phasen unterteilt. Phase I bezieht sich auf den Differenzierungsprozess von mESCs in NPCs, und Phase II bezieht sich auf die nachfolgende Differenzierung von NPCs in Neuronen. Basierend auf den Prinzipien der einfachen Bedienung, der niedrigen Kosten, der leicht zugänglichen Materialien und der hohen Differenzierungseffizienz wurden sieben Protokolle in Phase I und drei Protokolle in Phase II auf der Grundlage des traditionellen stickigen Monolayer-Kultursystems oder embryoiden Körperbildungssystems^8,9ausgewählt. Die Differenzierungseffizienz von Protokollen in beiden Phasen wurde mittels Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay evaluiert. Durch die Kombination des effizientesten Protokolls jeder Phase haben wir die optimierte Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs etabliert.

Protocol

1. Maus embryonale Stammzellkultur Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Zellkultur-Gerichte oder Teller zu. 2 ml sterilisierte 0,1% Gelatine (0,1% w/v in Wasser) zu 60 mm Zellkulturschalen hinzufügen. Schaukeln Sie sanft, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturgerichte zu gewährleisten. Die Gerichte bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und 1 h beschichten lassen. Entfernen Sie die 0,1% Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen säen.HINWEIS: Nach dem…

Representative Results

2-Tage embryoide Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktion funktioniert am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs (Phase I). Um das optimale Protokoll zu bestimmen, das die Differenzierung von mESCs in NPCs (Phase I) am besten fördert, wurden 7 Protokolle sowohl auf A2lox als auch auf 129 mESCs (Tabelle 1) getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit Lichtmikroskop überwacht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate unter …

Discussion

In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache und effektive Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs mit kostengünstigen und leicht zu erhaltenden Materialien etabliert. Bei dieser Methode können 2 Tage embryoiden Körperbildung gefolgt von 6 Tagen RA-Induktion die Differenzierung von mESCs in NPCs wirksam fördern (Phase I-Protokoll 3). Für die Phase-II-Differenzierung induzieren N2B27 Medium II (Phase II-Protokoll 3) am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen. Um den Erfolg zu gewährleist…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650