Här etablerade vi en låg kostnad och lättanvänd metod som leder snabb och effektiv differentiering från embryonala stamceller till nervceller. Denna metod är lämplig för popularisering bland laboratorier och kan vara ett användbart verktyg för neurologisk forskning.
Neural differentiering av mus embryonala stamceller (mESCs) är ett potentiellt verktyg för att belysa de viktigaste mekanismerna som är involverade i neurogenes och potentiellt stöd i regenerativ medicin. Här etablerade vi en effektiv och lågkostnadsmetod för neuronal differentiering från mESCs in vitro, med hjälp av strategin för kombinatorisk screening. Under de förhållanden som definieras här tillåter 2-dagars embryoidkroppsbildning + 6-dagars retinsyrainduktionsprotokoll snabb och effektiv differentiering från mESCs till neurala prekursorceller (NPCs), vilket ses av bildandet av välstackade och neuritliknande A2lox och 129 derivat som är Nestin positiva. Det friska tillståndet hos embryoidkroppar och den tidspunkt vid vilken retinsyra (RA) appliceras, liksom RA-koncentrationerna, är avgörande i processen. I den efterföljande differentiering från NPCs till nervceller, N2B27 medium II (kompletteras av Neurobasal medium) kan bättre stödja långsiktiga underhåll och mognad av neuronala celler. Den presenterade metoden är mycket effektiv, låg kostnad och lätt att använda, och kan vara ett kraftfullt verktyg för neurobiologi och utvecklingsbiologisk forskning.
Embryonala stamceller (EIC) är pluripotenta och kan differentieras till neurala prekursorceller (NPC) och därefter till nervceller under vissa förhållanden1. ESC-baserad neurogenes ger den bästa plattformen för att efterlikna neurogenes, vilket fungerar som ett användbart verktyg för utvecklingsbiologiska studier och potentiellt stöd i regenerativ medicin2,3. Under de senaste decennierna har många strategier rapporterats för att inducera embryonal neurogenes, såsom den transgena metoden4, med hjälp av småmolekyler 5, med hjälp av en 3D-matrismikromiljö6, och samkulturtekniken7. De flesta av dessa protokoll är dock antingen tillståndsbegränsade eller svåra att använda, vilket innebär att de inte är lämpliga för användning i de flesta laboratorier.
För att hitta en lättanvänd och billig metod för att uppnå effektiv neural differentiering från mESCs användes en kombinatorisk screeningstrategi här. Som beskrivs i figur 1var hela processen med embryonal neurogenes uppdelad i 2 faser. Fas I avser differentieringsprocessen från mESC till nödlidande lån, och fas II avser den efterföljande differentieringen från nödlidande lån till nervceller. Baserat på principerna om enkel drift, låg kostnad, lättillgängliga material och hög differentieringseffektivitet valdes sju protokoll i fas I och tre protokoll i fas II baserat på det traditionella vidhäftande monolayerkultursystemet eller embryoidkroppsbildningssystemet8,9. Differentieringseffektiviteten av protokoll i båda faserna utvärderades med hjälp av cell morfologi observation och immunofluorescens analys. Genom att kombinera det mest effektiva protokollet i varje fas etablerade vi den optimerade metoden för neural differentiering från mESCs.
I den aktuella studien etablerade vi en enkel och effektiv metod för neuronal differentiering från mESCs, med låg kostnad och lättåthållna material. I denna metod kan 2 dagars embryoidkroppsbildning följt av 6 dagars RA-induktion effektivt främja differentiering av mESC till nödlidande lån (fas I-protokoll 3). För fas II-differentiering inducerar N2B27 medium II (fas II-protokoll 3) mest effektivt differentiering från NPC till nervceller. För att säkerställa framgång bör mer uppmärksamhet ägnas åt fle…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31501099) och medelålders och unga vid utbildningsdepartementet i Hubeiprovinsen, Kina (nr. Q20191104). Och vi tackar professor Wensheng Deng vid Wuhan University of Science and Technology för att ha tillhandahållit musens embryonala stamcellslinjer A2lox.
Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
Coverslips | NEST | 801007 | |
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
6 – well plate | Corning | 3516 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |